大蒜素抑制人脑胶质瘤U251细胞株生长及其机制的实验研究

研究背景及目的：胶质瘤是常见的高恶性度的颅内肿瘤，虽经手术、放疗及化疗等综合治疗后，患者的存活率仍低，大多数患者从确诊时计算，存活时间不到1年。患病后对患者和家庭造成极大的身心痛苦和经济负担。目前的治疗恶性胶质瘤的药物很多，但副作用大，加之肿瘤细胞日益产生的耐药性，影响了药物的疗效，因此，迫切需要寻找并研制出更好的治疗药物。大蒜中所含的抗癌活性成分-大蒜素，作为一种天然来源的二烯丙基三硫化物（DADS），有希望成为治疗胶质瘤的有效药物。国内外学者经细胞和动物实验证实，大蒜素对胃癌、肝癌、膀胱癌、白血病等肿瘤细胞及组织有抑制和杀伤作用。但鲜见对大蒜素应用于胶质瘤的报道。本实验拟（1）观察大蒜素对体外培养的人脑胶质瘤U251细胞株的形态学及细胞周期的影响，探讨大蒜素是否对U251细胞株具有增殖抑制作用；（2）观察大蒜素对U251细胞凋亡的影响；（3）观察大蒜素作用U251细胞后，bcl-2/bax基因表达的变化，初步探讨大蒜素诱导U251细胞凋亡的相关机制。方法：1.CCK-8法检测不同浓度大蒜素作用12、24、48h后对U251细胞增殖的影响。2.荧光显微镜观察经大蒜素作用24h后的Hoechst33342荧光染色后凋亡细胞形态。3.流式细胞仪检测经AnnexinV-FITC和PI双染后的细胞凋亡率，并检测细胞周期的改变。4.免疫组化法检测不同浓度大蒜素处理后细胞的bcl-2和bax基因表达的灰度值变化。结果：1.用CCK8-法测定并根据公式计算不同浓度、不同作用时间后的细胞存活率，所得数据采用析因设计资料的方差分析，按检验水准α=0.05，可知，不同浓度大蒜素与其对U251细胞不同作用时间的交互效应无统计学意义（F=1.659，P=0.128）。故采用无交互效应的两因素方差分析。由统计结果可知，大蒜素对U251细胞的作用有时间依赖性（F=25.307，P<0.001）和浓度依赖性（F=80.713，P<0.001）。随大蒜素作用浓度的增加、作用时间的延长，U251细胞受抑制作用越明显。根据中效方程式，求出大蒜素作用12、24、48h后U251细胞的半数抑制浓度(IC50)分别为55.1μg/ml、39.5μg/ml、21.6μg/ml。2.流式细胞仪检测0、40μg/ml大蒜素作用U251细胞24h后细胞周期G1、S、G2期分别占的百分比，经单因素方差分析，组间比较用t检验，得到0μg/ml组G1、S、G2期分别为（54.00±2.01）%、（23.56±1.62）%、（21.26±1.08）%，40μg/ml组G1、S、G2期分别为（67.41±2.14）%、（16.35±2.98）%、（13.90±1.18）%，差异有统计学意义（P<0.001）。提示大蒜素作用后，U251细胞周期中G1期比例升高，S、G2期比例降低。3.流式细胞仪检测浓度为0、20、40μg/ml大蒜素组作用U251细胞后的凋亡率，经单因素方差分析，LSD-t检验，0、20、40μg/ml大蒜素组的凋亡率分别为（2.54±0.57）%、（28.34±3.53）%、（46.57±2.97）%，各浓度组间比较，差异有统计学意义（P<0.001）。提示大蒜素所致U251细胞凋亡为浓度依赖关系，大蒜素的作用浓度越高，细胞凋亡越明显。因而大蒜素能诱导细胞凋亡。4.40μg/ml大蒜素作用U251细胞24h后，经Hoechst33342荧光染色，在荧光显微镜下观察，可见凋亡细胞，细胞体积缩小，细胞核固缩、凝聚，核染色质边集，出现浓染致密的强蓝色颗粒块荧光信号。5.免疫组化法经0、20、40μg/ml大蒜素作用24h后，分别测量细胞浆中bcl-2和bax表达的灰度值，经单因素方差分析，LSD-t检验，得到bcl-2表达的灰度值分别为84.6±3.3、124.6±3.7、147.5±3.3，bax表达的灰度值分别为154.8±2.8、134.5±4.3、104.5±2.7，各浓度组间比较，有统计学意义（P<0.001）。随着大蒜素浓度的增加，bax基因表达的灰度值下降，bcl-2基因表达的灰度值升高。说明bax的基因表达逐渐增强，而bcl-2的基因表达逐渐减弱。提示大蒜素通过下调U251细胞的bcl-2表达，上调bax表达来诱导细胞凋亡。结论：1.大蒜素能抑制U251胶质瘤细胞的增殖，抑制作用具有浓度、时间依赖性。2.大蒜素能诱导U251细胞凋亡，作用强度与其浓度相关。3.大蒜素能改变U251细胞周期，主要发生在G1期比例升高，S，G2期比例降低。4.大蒜素抑制U251细胞凋亡的机制与下调bcl-2表达和上调bax表达有关。