几种氨基糖对受损心肌细胞和心肌组织的保护作用

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心脏病(heart disease)不论从形成机理还是从危害程度上分类,其对心脏的最基本伤害均是引起不同程度的心肌细胞损伤。壳聚糖是甲壳素脱乙酰后得到的高分子氨基多糖,具有良好的相容性、生物功能性、安全性和可降解性,被广泛应用于医药、食品、化工等领域。随着壳聚糖改性修饰的深入和在医药、生物技术领域研究的深入,低分子量壳聚糖衍生物的功能性和安全性评价成为一个重要的研究内容。硫酸软骨素是一种糖胺聚糖,易溶于水,对维持细胞环境的相对稳定和正常生理功能起到重要作用。长时间用药的经验显示大分子的硫酸软骨素作用效果比较缓慢。将硫酸软骨素降解得小分子硫酸软骨素,对其进行功能性评价,比较其与大分子硫酸软骨素的作用效果,具有重要的研究意义。本课题以壳聚糖衍生物和硫酸软骨素为基本材料,通过酶降解法,纯化得到低分子量壳聚糖衍生物和低分子量硫酸软骨素,开展了理化性质测定,在细胞水平和动物水平评价了壳聚糖衍生物和硫酸软骨素对受损心肌细胞和组织的保护作用,为壳聚糖衍生物和硫酸软骨素的进一步开发提供了实验依据。本实验取得了以下几个方面的成果和进展:1.将羧甲基壳聚糖和硫酸软骨素纯化后分别经壳聚糖酶和硫酸软骨素酶降解,制备了羧甲基壳寡糖、中分子硫酸软骨素和小分子硫酸软骨素。2.对七种氨基糖(N-乙酰氨基葡萄糖、磺酸化壳寡糖、高脱乙酰度壳寡糖、低脱乙酰度壳寡糖、羧甲基壳聚糖、羧甲基壳寡糖、硫酸软骨素)进行理化性质的测定。3.采用显微观察法和MTT法,测定上述7种氨基糖对于正常H9c2心肌细胞的作用,表明7种氨基糖均无细胞毒性,且不同程度地促进H9c2细胞的生长和增殖,N-乙酰氨基葡萄糖、磺酸化壳寡糖、低脱乙酰度壳寡糖、高脱乙酰度壳寡糖、羧甲基壳寡糖的最佳作用浓度均为50μg·mL-1,羧甲基壳聚糖的最佳作用浓度为100μg·mL-1,小分子硫酸软骨素的最佳作用浓度为200μg·mL-1,为氨基糖的后续实验应用提供了理论支持。4.建立体外培养的H9c2心肌细胞损伤模型,评价7种氨基糖对受损心肌细胞的作用。通过显微观察法和MTT法结果显示,7种糖对于受损心肌细胞的生长有良好的促进作用,其中小分子硫酸软骨素和羧甲基壳寡糖促进受损心肌细胞的生长和增殖的效果较为突出。小分子硫酸软骨素的最佳作用浓度为200μg·mL-1,羧甲基壳寡糖的最佳作用浓度为50μg·mL-1。5.给予异丙肾上腺素复制大鼠心肌梗塞模型,在此基础上评价羧甲基壳寡糖和小分子硫酸软骨素对受损心肌的保护作用。给心肌损伤的大鼠灌胃高、中、低剂量的羧甲基壳寡糖和小分子硫酸软骨素,于连续灌胃7d和14d时取血,检测、比较血清中心脏标志酶(乳酸脱氢酶、肌酸激酶、谷草转氨酶)的含量,并制作组织切片进行组织病理观察。通过血清标志酶的检测发现羧甲基壳寡糖和小分子硫酸软骨素作用效果相近,同剂量的两种糖进行差异性分析,差异不显著(P>0.05)。在用糖剂量上,7d时中剂量组与高剂量组初步表现出用糖治疗的优越性(中剂量组、高剂量组与ISO损伤对照组比较,具有显著性差异P<0.01);14d时,高剂量组基本恢复正常(高剂量组与正常组进行比较,差异不显著P>0.05)。组织切片观察结果与血清标志酶表现结果一致。证明了两种糖能够促进受损心肌的修复。6.给予异丙肾上腺素法复制大鼠心肌梗塞模型,评价不同分子量硫酸软骨素对受损心肌的保护作用。血清标志酶含量检测结果表明,小分子硫酸软骨素和中分子硫酸软骨素能明显促进受损心肌的修复,尤其是小分子硫酸软骨素组作用效果最突出:将各给糖组与ISO损伤对照组进行差异性比较,7d时小分子硫酸软骨素组表现出显著性差异(P<0.05),14d和21d时小分子硫酸软骨素组表现出极显著性差异(P<0.01);21d时将各给糖组与正常组进行比较,仅小分子硫酸软骨素组表现差异不显著(P>0.05),说明21d时小分子硫酸软骨素组基本恢复正常。
摘要第5-7页
Abstract第7-9页
第一章 文章综述第15-31页
    第一节 甲壳素、壳聚糖及其衍生物概述第15-21页
        1.1 甲壳素、壳聚糖及其衍生物第15-16页
        1.2 甲壳素、壳聚糖及其衍生物的研究意义第16页
        1.3 甲壳素、壳聚糖及其衍生物的药理作用第16-17页
        1.4 甲壳素、壳聚糖及其衍生物的用途第17-21页
    第二节 硫酸软骨素概述第21-24页
        2.1 硫酸软骨素基本概况第21页
        2.2 硫酸软骨素的药理作用第21-23页
        2.3 硫酸软骨素的应用第23页
        2.4 低分子量硫酸软骨素的制备与应用第23-24页
    第三节 心肌梗塞概述第24-29页
        3.1 心肌梗塞基本概况第24-25页
        3.2 心肌梗塞的病理特征第25页
        3.3 检测心肌损伤和坏死的标志物第25-27页
        3.4 心肌梗塞的治疗第27页
        3.5 研究心肌梗塞的实验模型第27-29页
    第四节 壳聚糖衍生物、硫酸软骨素在心脏病治疗中的作用第29-31页
第二章 壳聚糖衍生物和不同分子量硫酸软骨素的制备和性质测定第31-42页
    1 材料、试剂与仪器第31-32页
        1.1 材料与试剂第31页
        1.2 主要仪器第31-32页
    2 实验材料的制备与纯化第32-33页
        2.1 羧甲基壳聚糖的纯化与羧甲基壳寡糖的制备第32页
        2.2 硫酸软骨素的纯化及不同分子量硫酸软骨素的制备第32-33页
    3 实验材料的性质测定第33-37页
        3.1 水分测定第33页
        3.2 灰分测定第33-34页
        3.3 脱乙酰度的测定第34-35页
        3.4 取代度的测定第35-37页
        3.5 高、中、低分子量硫酸软骨素的薄层层析第37页
        3.6 中分子量硫酸软骨素、低分子量硫酸软骨素和羧甲基壳寡糖聚合和分子量分布的测定第37页
    4 结果与讨论第37-41页
        4.1 理化性质测定结果第37-38页
        4.2 高、中、低分子量硫酸软骨素的薄层层析结果第38-39页
        4.3 质谱分析结果第39-41页
    5 本章小结第41-42页
第三章 壳聚糖衍生物和硫酸软骨素对正常H9C2心肌细胞体外生长的影响第42-53页
    1 材料、试剂与仪器第42-43页
        1.1 材料与试剂第42-43页
        1.2 主要仪器第43页
    2 实验方法第43-45页
        2.1 溶液的配制第43-44页
        2.2 H9c2心肌细胞株的培养第44页
        2.3 H9c2大鼠心肌细胞生长曲线的测定第44-45页
        2.4 7种氨基糖对正常心肌细胞体外生长的影响第45页
        2.5 数据分析第45页
    3 结果与讨论第45-51页
        3.1 大鼠心肌细胞H9c2生长曲线第45-46页
        3.2 7种氨基糖对正常心肌细胞体外生长的影响第46-51页
    4 本章小结第51-53页
第四章 壳聚糖衍生物和硫酸软骨素对异丙肾上腺素诱导的H9C2心肌细胞损伤的保护作用评价第53-62页
    1 材料、试剂与仪器第53页
    2 实验方法第53-54页
        2.1 心肌细胞损伤模型的建立第53-54页
        2.2 7种氨基糖对损伤心肌细胞的保护作用第54页
        2.3 数据分析第54页
    3 结果与讨论第54-61页
        3.1 心肌细胞损伤模型的建立第54-55页
        3.2 7种氨基糖对损伤心肌细胞的保护作用第55-60页
        3.3 7种氨基糖对损伤H9c2细胞保护作用的最佳效果比较第60-61页
    4 本章小结第61-62页
第五章 小分子硫酸软骨素和羧甲基壳寡糖对大鼠心肌损伤的保护作用评价第62-71页
    1 材料、试剂与仪器第62-63页
        1.1 材料与试剂第62页
        1.2 主要仪器第62-63页
    2 实验方法第63-65页
        2.1 盐酸异丙肾上腺素诱导的大鼠心肌损伤模型的建立第63页
        2.2 两种糖对大鼠损伤心肌的影响第63-64页
        2.3 数据分析第64页
        2.4 组织病理学切片的制作第64-65页
    3 结果与讨论第65-70页
        3.1 盐酸异丙肾上腺素诱导的大鼠心肌损伤模型第65-66页
        3.2 小分子硫酸软骨素和羧甲基壳寡糖对损伤心肌组织的保护作用第66-70页
    4 本章小结第70-71页
第六章 不同分子量硫酸软骨素对大鼠心肌损伤的保护作用评价第71-77页
    1 材料、试剂与仪器第71页
        1.1 材料与试剂第71页
        1.2 主要仪器第71页
    2 实验方法第71-72页
        2.1 盐酸异丙肾上腺素诱导的大鼠心肌损伤模型的建立第71-72页
        2.2 不同分子量硫酸软骨素对大鼠损伤心肌的影响第72页
        2.3 数据分析第72页
        2.4 组织病理学切片的制作与观察第72页
    3 结果与讨论第72-76页
    4 本章小结第76-77页
总结第77-78页
主要创新点第78页
存在的不足与进一步研究计划第78-79页
参考文献第79-87页
致谢第87-88页
个人简历第88页
发表的学术论文第88页
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