中国5个少数民族群体中选择压力对HLA-G基因3UTR区域作用研究

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HLA-G (human leucocyte antigen-G, HLA-G)是非典型HLA-Ⅰ类分子,在自身免疫及适应性免疫调节中发挥重要的免疫调节作用。HLA-G基因不仅在妊娠过程中对维持母-胎免疫耐受、保证胎儿免受母体免疫攻击起着重要作用,而且在病原微生物感染中,HLA-G基因可以通过调节基因表达,抵抗及清除病原微生物,维持自身免疫调节作用。目前有研究认为,HLA-G基因8号外显子3’UTR区域至少存在3个多态性位点与HLA-G基因mRNA的表达相关,该区域的多态性在自身免疫性疾病,感染性疾病,先天性流产、先兆子痫等疾病的易感性相关。HLA-G基因3’UTR区域的多态性可能是一个有用的标志,对疾病及病原微生物感染的研究中具有一定的价值。对HLA-G基因3’UTR区域多态性在不同人群中研究的结果显示,HLA-G基因3’UTR区域的多态性在不同群体中的分布存在一定的差异。这种差异会对群体基因频率筛查、病例/对照研究造成误差或假阳性的结果。因此,本文拟对中国5个南北方少数民族群体HLA-G基因3’UTR区域多态性进行研究,试阐明遗传背景及选择压力对其多态性的影响。本研究对中国5个少数民族群体(水族135人,仡佬族110人,傣族97人,蒙古族43人,柯尔克孜族47人)进行HLA-G基因8号外显子3’UTR区域多态位性点的基因分型,以得到中国5个少数民族群体HLA-G基因8号外显子3’UTR区域多态性分布情况。同时,选择水族和仡佬族健康个体40人的10个短串联重复(short tandem repeats, S TR)中性多态性位点进行基因分型,并结合本研究室对傣族、蒙古族及柯尔克孜族的10个中性STR位点的基因分型研究结果,综合分析这10个中性STR位点在5个群体中的基因分布情况。采用SPSS17.0软件统计HLA-G基因3’UTR区域多态性位点等位基因频率并进行配对比较。采用Arlequin3.11软件计算多态性位点的杂合度、Hardy-Weinberg (hardy-Weinberg Equilibrium, HWE)检验及Ewens-Watterson中性检验(Ewens-Watterson test)。计算5个少数民族群体间的遗传分化指数FST及Nei的遗传距离Da,用Neighbor-Joining(N-J)法分别构建10个中性STR的系统发育树及HLA-G基因的基因树;采用STRUCTURE2.3软件对群体的STR结果进行聚类分析,以探讨选择压力和人口学事件,如瓶颈效应、奠基者效应,对HLA-G基因3’UTR区域多态性分布的影响。本研究结果显示:在蒙古族、柯尔克孜族和仡佬族的HLA-G基因3’UTR区中检测到8个多态性位点,在傣族和水族中有7个多态性位点。这些多态性位点包括+2961位点的14bp插入/缺失,+3003位点T/C,+3010位点G/C,+3027位点G/C,+3035位点C/A,+3142位点C/T,+3187位点G/A及+3196位点G/C。在群体中,平衡选择作用可以使等位基因的杂合子频率升高,人们也常用这一指标来衡量群体中是否存在平衡选择作用,但有时人群的瓶颈效应也会引起类似现象。3’UTR区域的多态性位点在3个南方少数民族群体的观察杂合度(observed heterozygosity,Ho)均高于期望杂合度(expected heterozygosity, He);在北方的两个少数民族群体中,期望杂合度和观察杂合度的关系是随机的。在5个南北方少数民族群体中,10个STR的期望杂合度和观察杂合度的关系都是随机的,这说明近期不存瓶颈效应。因此推测,在南方群体在进化过程中可能存在平衡选择作用的影响,而北方群体这一作用较弱。为了进一步验证平衡选择作用的影响,对3’UTR区域的单倍型进行Ewens-Watterson中性检测。根据Ewens-Watterson中性检测原理,平衡选择作用会使群体中的纯合度下降,比较群体中的观察纯合度和期望纯合度是否存在差异,可以判断这一区域是否受到平衡选择作用。本研究中,在3个南方群体中对3’UTR区域的Ewens-Watterson检测均具有统计学阳性,而在北方群体中的检验为阴性,这与杂合度的研究结果类似。因此,本研究中的3个南方群体受到平衡选择作用,而另两个北方群体受到此选择作用较弱。我们认为平衡选择作用影响HLA-G基因3’UTR区域多态性的分布。但群体的遗传背景差异也可能影响该区域在群体分布。因此,我们对这5个群体的遗传背景进行分析。基于10个中性STR所构建系统发育树的结构与STRUCTURE聚类分析均显示,南北方群体分布不同的支系上,北方两个少数民族群体的遗传结构相似,南方的仡佬族和水族的遗传结构相似。但是,基于HLA-G多态性位点所构建的基因树反映的群体遗传关系却与其群体的遗传背景不完全一致,遗传背景相似的水族和仡佬族在不同分支上。即在3个南方群体中,HLA-G基因3’UTR区域的基因树偏离群体的系统发育树。基于中性位点分析的5个群体的遗传关系并没有太偏离其地理、历史关系。因此,本研究组认为所观察到的群体杂合子频率的变化的确可能是由于平衡选择作用造成的。选择作用发生的生物学原因主要有两种,第一是由于优先流产引起的;第二是病原体驱动引起的。在本研究的5个群体中,总体来说,在3个南方群体中,HLA-G基因8号外显子3’UTR区域的多态性受到平衡选择作用,而北方群体此种选择作用较弱。比较南北方群体的居住地及病原微生物的活跃程度,我们推测这种差异可能是病原体所驱动的。而仡佬族和水族的遗传背景相似,所处地区病原谱相似,但这两个群体的HLA-G基因8号外显子3’UTR区域的多态性分布差异却很大,仡佬族受到平衡选择作用相对较弱,用病原学说来解释此现象较为牵强,因此,水族和傣族的HLA-G还可能受到相当程度的优先流产选择作用。综上所述,本研究确定了HLA-G基因3’UTR区域在一些民族群体中的确受到选择的作用,但随着群体族源或生活地域的改变,这一选择作用也处于波动之中。
摘要第5-7页
Abstract第7-8页
前言第9-11页
一.实验材料第11-14页
    1. 实验对象第11-12页
    2. 主要试剂及耗材第12-14页
        2.1. 外周血DNA提取所用的主要试剂第12页
        2.2. PCR反应试剂第12页
        2.3. 荧光标记引物PCR-STR分型试剂及耗材第12页
        2.4. 测序试剂和材料第12-13页
        2.5. 主要溶液的配置第13-14页
    3. 主要仪器设备第14页
        3.1. DNA提取主要使用的仪器第14页
        3.2. 基因分型及测序主要使用的仪器第14页
二.研究方法第14-25页
    1. 外周血的DNA的提取与定量第14-15页
        1.1. 试剂盒抽提外周血基因组DNA第14-15页
        1.2. DNA的定量第15页
    2. HLA-G基因8号外显子3'UTR区域14 bp插入/缺失多态性检测第15-21页
        2.1. 14bp插入/缺失多态检测第15-16页
        2.2. PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测第16-17页
        2.3. PCR产物测序验证第17-21页
    3. HLA-G基因8号外显子3'UTR多态性检测第21-22页
        3.1. PCR检测HLA-G基因8号外显子3'UTR多态性第21-22页
        3.2. PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测第22页
        3.3. PCR产物测序验证第22页
    4. PCR-STR分型第22-24页
        4.1. STR位点信息第22-23页
        4.2. PCR扩增反应体系第23页
        4.3. PCR扩增反应程序第23-24页
        4.4. 毛细管电泳样品的准备第24页
        4.5. 荧光标记引物PCR扩增产物在基因自动化分析仪上检测第24页
    5. 数据分析第24-25页
        5.1. 原始数据分析第24页
        5.2. 采用SPSS17.0统计分析软件包第24-25页
        5.3. 采用Arlequin3.11群体遗传数据分析软件包第25页
        5.4. 采用Poptree 2 software软件包第25页
        5.5. 采用Structure software Version 2.3软件包第25页
三. 研究结果第25-41页
    1. 14bp插入/缺失琼脂糖凝胶电泳结果第25-26页
    2. PCR产物测序验证第26页
    3. HLA-G基因3'UTR区域的多态性检测第26-27页
    4. 10个STR等位基因扫描及分型结果第27-29页
    5. Hardy-Weinberg平衡检验及杂合度分析第29-32页
        5.1 5个 少数民族群体HLA-G基因8号外显子S'UTR区域的Hardy-Weinberg平衡检验及杂合度分析第29-30页
        5.2 5个少数民族群体10个中性STR位点的Hardy-Weinberg平衡检验及杂合度分析第30-32页
    6. 5个少数民族群体HLA-G基因8号外显子3'UTR区域的等位基因分布频率的χ2配对比较第32-33页
    7. 连锁不平衡分析和单倍型构建分析第33页
    8. 单倍型在5个群体中分布的Ewens-Watterson中性检测第33-34页
    9. 5个群体HLA-G基因8号外显子3'UTR区域的单倍型类群分布及比较第34-35页
    10. 族群间遗传分化指数(F_(ST))及Nei的遗传距离Da第35-37页
        10.1. HLA-G基因3'UTR区域8个多态性位点族群间遗传分化指数(F_(ST))及Nei的遗传距离Da第35-36页
        10.2. 10个STR位点的族群间遗传分化指数(F_(ST))及Nei的遗传距离Da第36-37页
    11. 系统发育树及基因树的构建第37-39页
        11.1. HLA-G基因3'UTR区域构建的基因树第37-38页
        11.2. 10个中性STR构建的系统发育树第38-39页
    12. 聚类分析第39-41页
四.讨论第41-45页
    1. HLA-G基因3'UTR区域多态性位点在不同群体中分布存在差异第41页
    2. HLA-G基因8号外显子3'UTR区域在5个少数民族群体中分布受到平衡选择作用第41-43页
    3. 引起平衡选择作用的原因第43-45页
本文总结与展望第45-47页
    小结第45-46页
    展望第46-47页
参考文献第47-50页
附录第50-58页
    附录1 缩略语表第50-51页
    附录2第51-53页
    附录3第53-58页
致谢第58-59页
个人简历第59-60页
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