鸡球虫病是危害现代化养鸡业的重大疫病。由于耐药虫株的出现及残留药物对人体的危害,使药物防治受到限制。免疫预防已成为当前研究的热点,但目前对球虫的免疫机制尚未完全阐明,不同种株球虫共有的保护性抗原尚未得到,已有的疫苗不能对所有种或同一种不同株的球虫产生完全保护性免疫。利用杂交技术培育杂交虫株,以获得杂交亲本株的遗传标记(如:共同抗原等),这在国外对耐药虫株的研究中已见报道。本研究利用杂交技术对不同地理株柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)进行了杂交,应用RAPD技术鉴别、分离了杂交虫株,并对不同地理株及其杂交虫株进行了免疫保护性研究,具体内容如下: 杂交亲本株的选择:用五个不同地理株E.tenella,即:广州株、保定株、长春株、北京株、沈阳株,对12日龄雏鸡分别进行免疫攻虫,通过OPG计数,粪便计分,盲肠病变计分,增重测定,计算保护率,选择了免疫原性好且具有较强免疫保护力的广州株、保定株、长春株作为杂交亲本株。 RAPD分析方法的建立:应用RAPD(随机引物扩增多态性DNA)技术,对三个杂交亲本株广州株、保定株、长春株及它们的子代虫株进行了分析(30条随机引物)。在RAPD分析过程中,发现广州株、保定株、长春株之间存在基因差异,相似值为0.6225~0.6977,平均为0.6473。三株传代后,子代与亲代间基因差异均不大,相似值平均为0.9826。根据相似值,列出了相似性矩阵,并绘制了亲缘关系树状图,从而建立了应用RAPD技术鉴定不同地理株柔嫩艾美耳球虫的方法。 杂交虫株的培育:利用杂交技术对广州株、保定株、长春株进行了杂交,通过单卵囊技术分离杂交后代,并进行单卵囊扩增。依据建立的RAPD分析方法,对17个保定株与长春株的杂交后代的单卵囊扩增物进行了分析,在分析中发现一株卵囊的RAPD谱带与其它卵囊的不同,且其与两亲本株和子代株的相似性也与其它虫株不同,即:此虫株与两亲本株间的相似值为0.7509~0.8564。依据亲缘关系树状图,确定该虫株为保定株与长春株的杂交虫株(杂交一代,F1)。获得的杂交FI进一步与广州株进行杂交,并用RA PD方法对门个杂交后代单卵囊扩增物进行分析,找到了一株与亲本株相似性为0.7865~0.8216的虫株,依据亲缘关系树状图,确定该虫株为杂交虫株(杂交二代,FZ)。 杂交虫株的免疫保护性:将获得的杂交 FI株和杂交 FZ虫株对 12日龄雏鸡免疫攻虫,结果发现:杂交 FI、FZ株均有强的致病性,也具较好的免疫原性。交叉免疫实验结果证明:杂交FZ株免疫的雏鸡对不同虫株抱子化卵囊的攻击均有强的抵抗力,免疫保护率平均为84%。用长春株、保定株、广州株、杂交FI株、杂交FZ株分别免疫雏鸡,抽血进行CD4“、CDS+T细胞检测,结果各虫株均能引起两种T细胞数量增加,其中以FZ株引起的变化显著T<几05)。 本研究的结果为下一步深入研究杂交虫株免疫保护机理及找到不同地理株球虫共同的保护性抗原奠定了基础,进而为研制适合不同地理株的球虫疫苗提供了实验依据和理论基础。