通过优化蛋白表面的电荷分布来对腈水解酶的热稳定性进行理性设计

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本文旨在通过计算学手段来探索蛋白质表面的静电分布对蛋白质热稳定性的贡献,提出优化表面的静电作用将有利于蛋白质的热稳定性这一假设,并通过设计突变来证明我们的结论。文中以一株腈水解酶(NCBI编号,AJ248287)作为研究对象,以1J31为模板,利用Discovery studio来进行蛋白质建模,与模板的一致性达到了84%,模型评估中,所建模型abyssi.B99990005 Verify Score为249.05,低于模板的248.12。说明所建模型是可靠的。再以获取的模型为基础,使用Macrodox软件,识别和挑选位于蛋白质表面的可电离氨基酸,共挑选了GLU15, GLU24, GLU51, GLU58, GLU67, ASP93, GLU125, GLU200, GLU227, ASP236共10个位点,每一位点将其突变成R基电负性为中性的氨基酸ALA,和突变成电负性相反的氨基酸LYS,其中的三株突变显示热稳定性发生了显著的变化,且仍具备活力。证明了这一方法的可行性。另外文章中基于TK-SA模型编写了一个程序来定量模拟蛋白表面的静电作用对蛋白质稳定性的影响,用ΔGqq来描述静电分布对蛋白质的稳定性的影响。对上述三株突变使用该程序进行了计算,得到的结果也符合程序的设定。证明程序能够定量描述静电作用对蛋白稳定性的影响。
摘要第5-6页
Abstract第6页
第一章 绪论第10-25页
    1.1 腈水解酶简介第10-16页
        1.1.1 腈水解酶概述第10页
        1.1.2 腈水解酶的分类第10-12页
        1.1.3 腈水解酶的结构特点第12-15页
        1.1.4 腈水解酶的催化机制第15-16页
    1.2 结构分析及分子建模简介第16-19页
        1.2.1 蛋白质结构的模拟和预测第17页
        1.2.2 同源建模的一般步骤第17-19页
    1.3 酶的热稳定性的机制分析和改造第19-23页
        1.3.1 酶的热稳定性的概述第20页
        1.3.2 酶的耐热机制第20-21页
        1.3.3 提高蛋白质热稳定性的策略第21-22页
        1.3.4 通过改造蛋白表面的电荷分布来提高热稳定性第22-23页
    1.4 本课题的目标、内容及意义第23-25页
第二章 腈水解酶的三维结构的构建和分析第25-32页
    2.1 引言第25页
    2.2 材料与方法第25-26页
        2.2.1 硬件配置第25页
        2.2.2 软件配置第25页
        2.2.3 实验流程简介第25-26页
    2.3 结果与讨论第26-31页
        2.3.1 搜索模板的结果第27页
        2.3.2 初始序列的比对第27-28页
        2.3.3 模型的评估第28-29页
        2.3.4 模型的优化第29-30页
        2.3.5 PaNit模型的结构特点第30-31页
    2.4 本章小结第31-32页
第三章 突变热点的选择第32-40页
    3.1 引言第32-33页
    3.2 材料与方法第33-35页
        3.2.1 硬件配置第33页
        3.2.2 软件配置第33页
        3.2.3 实验流程第33-35页
    3.3 结果与讨论第35-39页
        3.3.1 利用Macrodox对建模蛋白进行预处理第35页
        3.3.2 输出初步突变位点SITES_LIST.TXT第35页
        3.3.3 利用Macrodox计算溶剂可接触性(SA),修改SITES_LIST.TXT第35-36页
        3.3.4 按包埋率筛选突变氨基酸第36-37页
        3.3.5 输入surface命令,得到对应的氨基酸的SA第37-38页
        3.3.6 剔除与两个亚基间有联系的氨基酸第38页
        3.3.7 剔除C末端的氨基酸第38页
        3.3.8 提出突变位点第38-39页
    3.4 本章小结第39-40页
第四章 TK-SA模型的编写和腈水解酶PANIT的理性设计第40-53页
    4.1 引言第40-41页
    4.2 材料与方法第41-45页
        4.2.1 硬件配置第41页
        4.2.2 软件配置第41页
        4.2.3 实验方法第41-45页
    4.3 结果与讨论第45-52页
        4.3.1 程序编写源码如下第45-52页
        4.3.2 突变的氨基酸的计算结果第52页
    4.4 本章小结第52-53页
第五章 菌株的构建和突变实验第53-61页
    5.1 引言第53页
    5.2 材料与方法第53-59页
        5.2.1 主要试剂第53-55页
        5.2.2 实验方法第55-59页
    5.3 结果与讨论第59-60页
        5.3.1 突变结果第59页
        5.3.2 酶活的测定结果第59-60页
    5.4 本章小结第60-61页
第六章 结论与展望第61-62页
    6.1 结论第61页
    6.2 展望第61-62页
参考文献第62-65页
致谢第65页
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