剪切力作用下红豆杉细胞机械信号转导和代谢适应机制研究

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揭示剪切力对植物细胞作用的机理对植物细胞培养反应器的设计与放大以及优化操作具有重要价值,本文的研究策略:设计均匀流场特别是层流剪切场反应器培养红豆杉细胞,通过研究磷脂组变化规律,揭示磷脂在机械信号转导的作用;通过分析膜脂组成的变化规律,研究细胞膜在机械信号转导中的作用;通过研究小分子代谢组的适应性变化,探讨使植物细胞能够适应剪切力的防御机制;通过研究次生代谢产物的变化规律,探索提高紫杉醇及其它紫杉烷产量的方法。基于LC/ESI/MS系统分析剪切力作用下红豆杉细胞磷脂分子变化,并运用偏最小二乘法等方法对数据进行信息抽提,发现PA和LysoPC变化最显著且含量明显增加,通过抑制剂实验发现剪切力能够激活PLC和PLD从而导致PA含量增加,表明磷脂信号参与了剪切信号转导过程,并对剪切力作用下磷脂相互转化传递剪切信号的机制进行了阐述。基于LC/ESI/MS和GC-TOF-MS系统分析剪切力作用下红豆杉细胞膜脂(磷脂、脂肪酸、甾醇)组成的变化,发现膜组成在剪切力作用下存在有结构性磷脂含量降低、细胞以牺牲谷甾醇和菜油甾醇为代价增加豆甾醇的含量、豆甾醇/磷脂比例升高、单不饱和脂肪酸和超长链饱和脂肪酸含量增加等主要变化,表明了细胞膜为适应剪切力发生的改变,进而揭示了剪切信号转导的分子基础。基于GC-TOF-MS系统分析剪切力作用下红豆杉细胞小分子代谢物变化,通过引入偏最小二乘法等方法,发现海藻糖、山梨糖醇、抗坏血酸、蔗糖和葡萄糖酸在剪切力作用下变化最显著。将所有代谢变化进行整合后发现剪切力抑制三羧酸循环、糖酵解和氮代谢等初级代谢途径的活性,细胞通过糖酵解途径和蔗糖代谢的共同诱导、积累相容性溶质及抗氧化等代谢调控措施来适应剪切环境,从代谢物水平上揭示了红豆杉细胞的剪切防御机制。基于UPLC/Q-TOF MS和LC/ESI/MS系统分析剪切力作用下红豆杉细胞次级代谢产物变化,发现除了少数特定种类紫杉烷外,剪切力作用下细胞中紫杉醇、其生物合成路径中间体以及大部分未参与到紫杉醇合成路径的紫杉烷类物质,它们的含量都有不同程度的降低。剪切力对紫杉烷代谢的影响主要包括:剪切力干扰了GGPP环化生成紫杉二烯的过程;增加了紫杉二烯进行羟化和酰化修饰过程中发生错误的几率;不利于功能团环氧丙烷环的形成,从而揭示了剪切力限制红豆杉细胞生产紫杉醇的可能机理。
摘要第3-4页
ABSTRACT第4-5页
前言第10-11页
第一章 文献综述第11-29页
    1.1 水流剪切力作用下植物细胞的剪切敏感性第11页
    1.2 植物细胞对机械胁迫的响应第11-15页
        1.2.1 植物细胞在机械胁迫下的生理变化第11-12页
        1.2.2 植物细胞对机械胁迫的应答机制第12-15页
    1.3 代谢物对环境胁迫的响应第15-23页
        1.3.1 磷脂第15-17页
        1.3.2 脂肪酸第17页
        1.3.3 甾醇第17-19页
        1.3.4 其它初级代谢物第19页
        1.3.5 紫杉烷类第19-23页
    1.4 基于质谱的代谢物检测和分析方法第23-27页
        1.4.1 样品准备第23页
        1.4.2 代谢物检测方法第23-26页
        1.4.3 代谢物鉴定第26-27页
        1.4.4 数据处理方法第27页
    1.5 本文的研究意义及主要研究内容第27-29页
第二章 红豆杉细胞机械信号转导过程中磷脂信号的激活第29-47页
    2.1 引言第29页
    2.2 材料与方法第29-35页
        2.2.1 主要仪器第29-30页
        2.2.2 主要试剂第30页
        2.2.3 细胞株系及其培养第30-31页
        2.2.4 Couette 反应器第31-32页
        2.2.5 磷脂的提取第32-33页
        2.2.6 磷脂的液相色谱串联质谱分析第33-34页
        2.2.7 数据的标准化和多元统计分析第34页
        2.2.8 PLD 活性的检测第34-35页
        2.2.9 PLC 活性的检测第35页
        2.2.10 统计处理第35页
    2.3 结果与讨论第35-46页
        2.3.1 剪切力作用下红豆杉细胞磷脂代谢变化第35-39页
        2.3.2 多元统计分析剪切力作用下细胞的磷脂代谢差异第39-42页
        2.3.3 PA 的产生机制第42-46页
    2.4 小结第46-47页
第三章 红豆杉细胞在剪切力作用下膜组成的变化第47-63页
    3.1 引言第47页
    3.2 材料与方法第47-51页
        3.2.1 主要仪器第47-48页
        3.2.2 主要试剂第48页
        3.2.3 细胞株系与培养第48页
        3.2.4 Couette 反应器第48页
        3.2.5 细胞活力的测定第48页
        3.2.6 细胞膜通透性的测定第48-49页
        3.2.7 磷脂的提取第49页
        3.2.8 磷脂的液相色谱串联质谱分析第49页
        3.2.9 红豆杉细胞中甾醇的提取第49页
        3.2.10 甾醇的气相色谱串联质谱分析第49-50页
        3.2.11 红豆杉细胞中脂肪酸的提取第50页
        3.2.12 脂肪酸的气相色谱串联质谱分析第50-51页
        3.2.13 色谱峰识别与去卷积第51页
        3.2.14 数据处理第51页
    3.3 结果与讨论第51-61页
        3.3.1 剪切力作用下细胞中甾醇和脂肪酸的分析第51-55页
        3.3.2 剪切力作用下结构性磷脂组成的改变第55-56页
        3.3.3 剪切力作用下甾醇组成的改变第56-59页
        3.3.4 剪切力作用下超长链饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸含量增加第59-61页
    3.4 小结第61-63页
第四章 代谢物水平上红豆杉细胞的剪切防御策略第63-80页
    4.1 前言第63页
    4.2 材料与方法第63-66页
        4.2.1 主要仪器与试剂第63-64页
        4.2.2 细胞株系及其培养第64页
        4.2.3 Couette 反应器第64页
        4.2.4 细胞活力和丙二醛(MDA)含量的测定第64页
        4.2.5 胞内代谢物的提取第64-65页
        4.2.6 GC-TOF-MS 检测代谢物第65页
        4.2.7 色谱峰识别与去卷积第65页
        4.2.8 多元统计分析第65-66页
        4.2.9 统计学处理第66页
    4.3 结果与讨论第66-79页
        4.3.1 剪切力作用下红豆杉细胞代谢物分析第66-71页
        4.3.2 多元统计分析剪切力作用下红豆杉细胞的代谢差异第71-73页
        4.3.3 胞内代谢物的含量变化第73-75页
        4.3.4 剪切力抑制初级代谢途径的活性第75-77页
        4.3.5 剪切力作用下细胞可能的防御机制第77-79页
    4.4 小结第79-80页
第五章 剪切力对紫杉烷代谢的影响及信号转导和代谢调控模型的建立第80-99页
    5.1 前言第80-81页
    5.2 材料与方法第81-83页
        5.2.1 主要仪器第81页
        5.2.2 主要试剂第81页
        5.2.3 细胞株系与培养第81页
        5.2.4 Couette 反应器第81页
        5.2.5 红豆杉细胞中紫杉烷类物质的提取第81-82页
        5.2.6 紫杉烷类物质的UPLC/Q-TOF MS 分析第82-83页
        5.2.7 MRM 定量第83页
        5.2.8 数据处理第83页
    5.3 结果与讨论第83-98页
        5.3.1 提取方法和分析条件的优化第83-88页
        5.3.2 剪切力对紫杉烷代谢的影响第88-97页
        5.3.3 剪切力作用下信号转导和代谢调控生物学模型的建立第97-98页
    5.4 小结第98-99页
第六章 结论与展望第99-102页
    6.1 结论第99-100页
    6.2 创新点第100-101页
    6.3 展望第101-102页
参考文献第102-117页
发表论文和参加科研情况说明第117-118页
缩写词与符号表第118-119页
致谢第119页
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