miR-375在人肝细胞癌中的表达及其调控信号通路的初筛

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miRNAs是近来发现的组19-24个核苷酸组成的非编码RNA分子,它们与基因表达的调控相关。这些小分子调控的基因参与体内多种生理进程例如细胞增殖、生长、分化、凋亡及其他等。MicroRNA在转录后水平调控目的基因的表达,有证据显示miRNA在胚胎形成、细胞分化以及在包括肿瘤在内的许多疾病的发病机制中起重要作用。microRNA-375(miR-375)是最早发现的miRNAs家族成员之,最初被认为是胰岛特异性microRNA,近几年的研究结果显示miR-375的表达异常与多种肿瘤的发生发展相关。目的:1)探明miR-375在人肝细胞癌中的表达及肝癌细胞株转染前后其的表达变化2) miR-375相关靶基因和调控信号通路的生物信息学分析方法:1) miR-375在人肝癌组织芯片和肝癌细胞株爬片的原位杂交实验2)实时定量PCR检测人肝癌细胞株转染前后miR-375的表达3)高通量基因芯片检测分析4株转染了miR-375mimic的肝癌细胞株,初步筛选miR-375调控的下游靶基因及相关信号通路结果:1)肝癌组织芯片的原位杂交结果显示,在75例肝癌组织中有41例表达阳性,34例表达阴性;在癌旁组织中,有2例表达阳性,73例表达阴性。miR-375的表达在肝癌组织中的表达明显高癌旁组织(p<0.005)。2)实时荧光定量RT-PCR结果显示,4株肝癌细胞株(HepG2、Huh-7、Li-7、SMMC-7721)中Huh-7、Li-7的miR-375的表达较另外两株细胞高,4株肝癌细胞转染后miR-375mimic后,miR-375的表达显著升高;mRNA表达谱芯片分析结果显示,与mimic control转染组比较,miR-375mimic转染的HepG2、Huh-7、Li-7、SMMC-7721细胞株中分别有2305、424、892和1050个基因表达上调(倍数值≤2.0);分别有2162、536、974、998个基因表达下调(倍数值≤-2.0);4个转染细胞株中的共上调基因有20个,共下调基因有17个。3)分别将前述筛选到的20个表达上调和17个表达下调的基因输入MAS生物信息学软件进行分析,对得出的结果加以整理,4个细胞株共有的上调相关信号通路54条,共有的下调相关信号通路下调48条,包括丝裂原激活蛋白激酶信号通路(MAPKinase Signaling Pathway)、焦点粘连信号通路(Focaladhesion)、胰岛素信号通路(Insμlin signaling pathway)、粘附链接信号通路(Adherens junction)、Wnt信号通路(Wnt signaling pathway)和细胞凋亡信号通路(Apoptosis)等。结论:1) miR-375在其在肝癌组织中的表达高于癌旁组织,提示miR-375可能在肝细胞癌的发生发展中起着重要的作用。2) miRNA原位杂交方法在组织标本上的应用,能定性并半定量反映miRNA的表达情况。3)以高通量基因芯片分析结果为基础,结合生物信息学手段,对miR-375调控的肝细胞肝癌相关基因网络与信号通路进行多元化筛选,为后续全面深入的研究肝细胞肝癌的发生发展机制提供了便利。
摘要第3-5页
Abstract第5-6页
目录第7-9页
英文缩略词表第9-10页
第1章 引言第10-13页
第2章 材料与方法第13-23页
    2.1 实验材料第13-16页
        2.1.1 细胞与组织芯片第13页
        2.1.2 主要仪器第13-14页
        2.1.3 主要试剂第14-16页
    2.2 实验方法第16-23页
        2.2.1 溶液配制第16页
        2.2.2 细胞培养第16-18页
        2.2.3 RNA 提取、逆转录与实时荧光定量-PCR第18-19页
        2.2.4 原位杂交第19-21页
        2.2.5 罗氏人全基因组表达谱芯片分析第21-22页
        2.2.6 统计处理第22-23页
第3章 结果第23-35页
    3.1 MIR-375 在人肝细胞癌组织芯片中的表达分析第23-26页
    3.2 MIR-375 调控信号通路的初步筛选第26-35页
        3.2.1 四株肝癌细胞株转染前后的实时荧光定量 PCR第26-28页
        3.2.2 RNA质量检测第28-29页
        3.2.3 mRNA表达谱芯片结果第29-35页
第4章 讨论第35-40页
    4.1 MIR-375 在人肝细胞癌组织芯片中的表达分析第35-37页
    4.2 MIR-375 调控信号通路的初步筛选第37-40页
第5章 结论与展望第40-41页
    5.1 结论第40页
    5.2 下一步工作计划第40-41页
致谢第41-42页
参考文献第42-46页
攻读学位期间研究成果第46-47页
综述第47-51页
    参考文献第50-51页
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