大多数鱼类性别决定与分化不仅受性别基因的控制,而且还受环境的影响,最终可能形成与基因型性别不一致的表型性别。实验已证明,在鱼类性别形成阶段体内雌雄激素比例是决定表型性别的直接原因。应用芳香化酶抑制剂(Aromatase inhibitors,AI)处理不仅可以使雌性同体的石斑鱼(Epinephlus coioides)雌性提前发生雄性转变,也可使大麻哈鱼(Oncorhynchus tshawytscha)、虹鳟(Oncorhynehus mykiss).罗非鱼(Tilapoa nilotica).斑马鱼(Danio rerio)等雌雄异体种类的仔鱼Cyp19a基因表达下调并发生雄性化逆转。但是在青鳉(Dryzias latipes)中同样的研究并没有出现类似的结果。由此可见,鱼类的性别形成机制是复杂多样的。鱼类单性培育是水产养殖业提高经济效益的重要途径,芳香化酶抑制剂对鱼类雄性化诱导机制的研究,不仅是鱼类性别控制理论的基础,更具有重要的实际生产意义,然而需要更多实验数据加以论证。暗纹东方纯(Takifugu obscurus)俗称淡水河豚,隶属东方纯属,是我国长江中下游珍贵的淡水鱼类。由于卵巢、肝和血液有剧毒而影响养殖和开发。在人工养殖条件下雄性河豚毒性较低,单雄性养殖有很好的前景。本文以暗纹东方鲀初孵仔鱼为实验对象,在克隆了暗纹东方鲀性腺Cyp19a、Dmrt1、Foxl2、Cypllb基因的cDNA序列基础上,将孵化7d(dah)的暗纹东方鲀仔鱼暴露于芳香化酶抑制剂来曲唑LE(letrozole,LE)(0、25、125、625、3125μg/L)中,暴露期为49d。检测实验仔稚鱼Cyp19a和Dmrtl基因的表达情况以及性腺的组织学变化。以期为探索单雄性暗纹东方纯诱导的可行性提供基础数据。1暗纹东方鲀性腺Dmrt1、Cyp19a、Foxl2、Cypl1b基因cDNA部分序列克隆及分析根据Genbank中已有的鱼类核苷酸序列,分别设计Cypl9a、Dmrt1、Foxl2、Cypllb基因的简并引物,并分别克隆获得了各基因cDNA片段。从暗纹东方鲀性腺中分别克隆了Cyp19a和Dmrtl的cDNA部分序列。Cyp19a片段长度为836bp,开放阅读框编码277个氨基酸。包含保守的I-螺旋区,芳香化酶特异保守区域以及血红素结合域。将该片段与已知脊椎动物Cyp19a进行同源性比较分析,结果显示其与同属的红鳍东方纯同源性最高,达100%,与人、鼠、蛙、鸡的亲缘性较远。Dmrtl片段为605bp,开放阅读框编码200个氨基酸,含有编码66个氨基酸的保守的DM框(DM domain)。同源性比较分析,所获得的部分序列与同属的红鳍东方纯同源性高,达到99%。但是与人、鼠、鸡的亲缘性较远。此外,还从暗纹东方纯性腺中克隆了Foxl2、CypllbcDNA部分序列。其中Foxl2序列为501bp,开放阅读框编码166个氨基酸,包括105个氨基酸组成的FH结构域(FH-domain)。同源性分析发现其与哺乳动物FH结构域,有高达96%的相似性。Cyp1lbcDNA序列为538bp,开放阅读框编码156个氨基酸,同源性分析显示所获得的部分序列与其它鱼类的相应部分序列同源性较高。2来曲唑对暗纹东方纯仔鱼性腺分化影响组织学研究表明,在42dah,对照组和25μg/LLE低浓度组暗纹东方纯性腺的组织分化已完成,精巢和卵巢各占50%左右。随着LE浓度的升高,雌鱼的百分比均有下降。在25μg/LLE浓度组中,雌鱼的百分比下降至30%,约20%的样本成为间性体,发生由雌性向雄性的性逆转现象；在625μg/L LE浓度组样本中未见典型的卵巢组织,雌鱼百分比降至0%,37%为间性体,其余为精巢；在3125μg/LLE高浓度组中未见典型的卵巢结构,样本的20%为间性体,80%为精巢.；3125μg/LLE高浓度组。在56dah时100%显示为雄性。3来曲唑对暗纹东方纯仔鱼Cyp19a和Dmrtl表达的影响RT-PCR结果显示,Cyp19a基因在雌性个体中明显表达,Dmrtl基因在雄性个体中明显表达。125μg/LLE组中,单一表达Cyp19a的样本下降至20%左右,约30%样本既表达Cyp19a,也表达Dmrtl。随着LE浓度升高,单一表达Cyp19a的样本数依次下降,当浓度达625μ/gL和3125μg/L时,Cyp19a表达率下降至0。在最高浓度3 125μg/L LE组中,单一表达Dmrtl的样本由70%(42dah)上升至100%(56dah)。4来曲唑对Cyp19a和Dmrtl基因的相对表达量的影响以暗纹东方纯β-actin为参比计算实验终点(56dah)时所有实验组暗纹东方纯性腺C)p19a和Dmrt1的相对表达量。结果显示：LE可导致暗纹东方纯性腺Cyp19a基因表达量下调,而且存在剂量依赖的抑制关系。LE浓度为125μg/L和625μg/L时,样本中Cyp19a基因表达量显著低于对照组雌性样本；LE浓度为3125μg/LLE时,所有样本Cyp19a基因的表达量与对照组雄性样本相近；Dmrt1基因表达则随着LE浓度的上升而上调；当LE浓度为625μg/L以上时,所有样本的Dmrt1表达量与对照组雄性样本无显著性差异。本实验表明,芳香化酶抑制剂来曲唑可使暗纹东方纯仔鱼发生雄性化逆转,逆转百分率与来曲唑浓度有关。逆转过程是内源激素平衡被改变的结果。
