淫羊藿多糖和糖蛋白的提取纯化、性质表征及其抗氧化、降血糖活性研究

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淫羊藿(Epimedium brevicornu)是我国特有的药食两用植物,在保健食品和医药工业中的应用广泛。许多古籍和中医著作中记载了淫羊藿调节血糖的功效,其是淫羊藿的重要生物活性之一。在民间,常将淫羊藿应用于糖尿病保健品中;在临床上,常用淫羊藿缓解糖尿病的症状。随着淫羊藿在降血糖方面关注度的提升,对其降血糖活性成分的研究也逐渐增多。相关文献表明,淫羊藿的降血糖功效与其所含的多糖、糖蛋白等成分有关。在文献调研的基础上,本文进行了淫羊藿多糖和糖蛋白的提取纯化、性质表征及其抗氧化、降血糖活性研究,为今后糖尿病保健食品的研发、淫羊藿资源的开发与应用、降血糖活性的研究提供一定的指导作用。采用超声波/微波协同提取法(UMSE)获取淫羊藿多糖(EbLP),正交试验优化提取工艺,得到UMSE的最优工艺为:粒度0.15×0.15 mm2,液固比30 mL·g-1,提取时间5 min。通过EbLP的全波长扫描试验、Molish试验、Fehling试验和碘-淀粉试验,可知EbLP为非淀粉多糖。对EbLP进行乙醇梯度分级,获得EbLP Ⅰ(乙醇体积分数为30%)、EbLP Ⅱ(乙醇体积分数为50%)和EbLP Ⅲ(乙醇体积分数为70%)。其中,EbLP Ⅱ对DPPH自由基和ABTS自由基有较好的清除作用,IC50值分别为0.42mg·mL-1和0.54 mg·mL-1;对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶有良好的抑制作用,IC50值分别为24.0mg·mL-1和1.1×10-1 mg·mL-1。用不同剂量的EbLP Ⅱ对糖尿病模型小鼠进行21天的治疗实验,EbLP Ⅱ灌胃组模型小鼠和阴性对照组模型小鼠对比,有如下结果:1)灌胃800 mg·kg-1·d-1 EbLP Ⅱ组模型小鼠的饮食量和饮水量明显的降低(P<0.05),体重明显的增加(P<0.05)。2)EbLP Ⅱ灌胃组模型小鼠的空腹血糖值(FBG)和糖化血清蛋白含量(GSP)快速下降(P<0.05),基本维持在正常水平。3)EbLPⅡ灌胃组模型小鼠肝脏、肾脏的肿胀现象得到有效控制,肝脏系数和肾脏系数显著性降低(P<0.05)。4)EbLP Ⅱ灌胃组模型小鼠的丙二醛(MDA)含量显著降低,谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活力显著升高(P<0.05)。综上,EbLP Ⅱ可以提升机体清除自由基的效率,降低脂质过氧化的发生,保护和恢复小鼠损伤的组织与器官,发挥调节血糖值,缓解糖尿病症状的作用。通过浸泡提取及盐析沉淀获取淫羊藿糖蛋白,经透析、Seveg脱蛋白后进行柱层析纯化。不同大孔吸附树脂(AB-8、D101、XDA-1、X-5)对淫羊藿糖蛋白的静态吸附与解析试验表明:D101大孔吸附树脂对淫羊蕾糖蛋白具有优良的吸附与解析性能,小于3h便可达到吸附饱和状态。动态吸附动力学试验表明:最佳上样浓度为0.075mg·mL(以多糖计算),最佳上样流速为1.0BV·h-1。采用不同极性的溶剂洗脱层析柱,获得糖蛋白组分Ⅰ、组分Ⅱ、组分Ⅲ和组分Ⅳ。四组分淫羊藿糖蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果表明:组分Ⅱ中糖蛋白含量最高。近一步研究可知:组分Ⅱ糖蛋白的pI= 5.6;单糖组成为:葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖;且存在O-连接型糖肽键。且组分Ⅱ糖蛋白可高效清除DPPH 自由基和 ABTS 自由基,IC50 值分别为 1.49×10-2 mg.mL-1 和 3.80×10-2 mg·mL-1。其对α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的抑制作用呈剂量依赖性,IC50值分别为1.15×10.1mg·mL-1和8.33×10-2 mg·mL-1。可见,组分Ⅱ糖蛋白有良好的抗氧化活性和抑制与血糖代谢相关酶的活性。综上可知,淫羊藿多糖、糖蛋白具有突出的降血糖活性;在缓解糖尿病并发症、调节糖尿病患者的血糖水平、提高机体的抗氧化能力等方面的效果显著,具有良好的开发潜力和发展前景。
摘要第3-5页
ABSTRACT第5-7页
第1章 文献综述第12-18页
    1.1 药食两用植物淫羊藿简介第12-13页
    1.2 降血糖与抗氧化的关系第13页
    1.3 植物多糖降血糖活性研究进展第13-14页
    1.4 植物糖蛋白降血糖活性研究进展第14-15页
    1.5 淫羊藿在调理糖尿病方面的应用第15页
    1.6 选题依据与研究意义第15-17页
    1.7 研究内容第17-18页
第2章 淫羊藿多糖的超声波/微波协同提取、分级纯化与性质表征第18-30页
    2.1 引言第18页
    2.2 材料与设备第18-19页
        2.2.1 试验材料与试剂第18页
        2.2.2 试验设备第18-19页
    2.3 试验方法第19-22页
        2.3.1 材料前处理第19页
        2.3.2 超声波/微波协同提取法(UMSE)第19页
        2.3.3 微波辅助提取法(MAE)第19-20页
        2.3.4 超声辅助提取法(UAE)第20页
        2.3.5 热水提取法(HWE)第20页
        2.3.6 多糖定量方法第20-21页
        2.3.7 多糖纯化方法第21页
        2.3.8 多糖性质表征方法第21-22页
            2.3.8.1 Molish试验方法第21页
            2.3.8.2 碘-淀粉试验方法第21页
            2.3.8.3 Fehling试验方法第21-22页
        2.3.9 多糖梯度分级醇沉方法第22页
        2.3.10 数据统计第22页
    2.4 结果与分析第22-28页
        2.4.1 提取参数对淫羊藿多糖提取量的影响第22-25页
        2.4.2 UMSE条件的优化第25-26页
        2.4.3 UMSE与传统提取方法的比较第26-27页
        2.4.4 多糖的纯化与性质表征第27-28页
        2.4.5 多糖的分级醇沉结果第28页
    2.5 小结第28-30页
第3章 淫羊藿多糖抗氧化、降血糖活性分析第30-44页
    3.1 引言第30页
    3.2 材料与设备第30-32页
        3.2.1 试验材料与试剂第30-31页
        3.2.2 试验设备第31-32页
    3.3 试验方法第32-36页
        3.3.1 抗氧化活性研究方法第32-33页
            3.3.1.1 淫羊藿多糖清除DPPH自由基的试验方法第32页
            3.3.1.2 淫羊藿多糖清除ABTS自由基的试验方法第32-33页
        3.3.2 α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶活性测定方法第33-34页
            3.3.2.1 淫羊藿多糖抑制α-淀粉酶的试验方法第33页
            3.3.2.2 淫羊藿多糖抑制α-葡萄糖苷酶的试验方法第33-34页
        3.3.3 体内降血糖活性研究方法第34-35页
            3.3.3.1 确定STZ诱导小鼠高血糖模型剂量的方法第34页
            3.3.3.2 高血糖模型小鼠的诱导、分组与处理方法第34页
            3.3.3.3 模型小鼠生化分析前处理方法第34-35页
            3.3.3.4 小鼠糖化血清蛋白含量的测量方法第35页
            3.3.3.5 小鼠谷胱甘肽过氧化物酶的测量方法第35页
            3.3.3.6 小鼠丙二醛含量的测量方法第35页
        3.3.4 数据统计第35-36页
    3.4 结果与分析第36-42页
        3.4.1 淫羊藿多糖的体外抗氧化活性第36页
        3.4.2 淫羊藿多糖的体外降血糖活性第36-37页
        3.4.3 淫羊藿多糖的体内降血糖活性第37-42页
            3.4.3.1 淫羊藿多糖对糖尿病模型小鼠并发症的影响第37-38页
            3.4.3.2 淫羊蕾多糖对糖尿病模型小鼠血糖的影响第38-41页
            3.4.3.3 淫羊藿多糖对糖尿病模型小鼠脏体比的影响第41页
            3.4.3.4 淫羊藿多糖对糖尿病模型小鼠抗氧化体系的影响第41-42页
    3.5 小结第42-44页
第4章 淫羊藿糖蛋白的提取纯化与性质表征第44-58页
    4.1 引言第44页
    4.2 材料与设备第44-45页
        4.2.1 试验材料与试剂第44页
        4.2.2 试验设备第44-45页
    4.3 试验方法第45-50页
        4.3.1 糖蛋白的提取方法第45页
        4.3.2 糖蛋白的纯化方法第45-47页
            4.3.2.1 透析方法第45页
            4.3.2.2 脱蛋白方法第45-46页
            4.3.2.3 大孔吸附树脂分离纯化方法第46-47页
                4.3.2.3.1 大孔吸附树脂预处理方法第46页
                4.3.2.3.2 大孔吸附树脂筛选方法第46页
                4.3.2.3.3 静态吸附动力学确定吸附时间的方法第46页
                4.3.2.3.4 动态吸附动力学优化分离纯化条件的方法第46-47页
                4.3.2.3.5 糖蛋白的柱层析分级方法第47页
        4.3.3 糖蛋白含量的测定方法第47-48页
            4.3.3.1 苯酚硫酸法测糖含量第47页
            4.3.3.2 考马斯亮蓝法(Bradford法)测蛋白浓度第47-48页
        4.3.4 糖蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法第48页
            2.3.4.1 样品的预处理方法第48页
            2.3.4.2 糖蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法第48页
            2.3.4.3 凝胶染色方法第48页
        4.3.5 糖蛋白等电点的测定方法第48-49页
        4.3.6 薄层色谱法(TLC)第49页
            4.3.6.1 糖蛋白的水解处理第49页
            4.3.6.2 糖蛋白单糖组成分析方法第49页
        4.3.7 β-消除反应方法第49-50页
    4.4 结果与分析第50-56页
        4.4.1 淫羊蕾糖蛋白的分离纯化第50-54页
            4.4.1.1 树脂的筛选第50-51页
            4.4.1.2 吸附时间的选择第51页
            4.4.1.3 上样浓度的优化第51-52页
            4.4.1.4 上样流速的优化第52-53页
            4.4.1.5 糖蛋白组分的分离第53-54页
        4.4.2 淫羊藿糖蛋白的性质表征第54-56页
            4.4.2.1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析第54页
            4.4.2.2 单糖组成分析第54-55页
            4.4.2.3 糖肽键类型分析第55页
            4.4.2.4 等电点分析第55-56页
    4.5 小结第56-58页
第5章 淫羊藿糖蛋白的抗氧化活性及其对α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶活力的影响第58-64页
    5.1 引言第58页
    5.2 材料与设备第58-59页
        5.2.1 试验材料与试剂第58页
        5.2.2 试验设备第58-59页
    5.3 试验方法第59页
        5.3.1 组分Ⅱ糖蛋白清除DPPH自由基的试验方法第59页
        5.3.2 组分Ⅱ糖蛋白清除ABTS自由基的试验方法第59页
        5.3.3 组分Ⅱ糖蛋白抑制α-淀粉酶的试验方法第59页
        5.3.4 组分Ⅱ糖蛋白抑制α-葡萄糖苷酶的试验方法第59页
    5.4 结果与分析第59-62页
        5.4.1 糖蛋白对DPPH自由基的清除作用第59-60页
        5.4.2 糖蛋白对ABTS自由基的清除作用第60-61页
        5.4.3 糖蛋白对α-淀粉酶的抑制作用第61页
        5.4.4 糖蛋白对α-葡萄糖苷酶的抑制作用第61-62页
    5.5 小结第62-64页
结论与展望第64-66页
    小结第64页
    展望第64-66页
参考文献第66-76页
致谢第76-78页
攻读学位期间研究成果第78页
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