Aj-vasa全长cDNA的克隆及其在仿刺参(Apostichopus japonicus)生殖系中的发育表达图式

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生殖细胞的发生是发育生物学研究的重要领域。vasa基因在许多动物生殖系细胞中具有表达特异性,被广泛用作生殖细胞的分子标记物,在动物生殖细胞发生和生殖调控等研究中起到了重要的作用。仿刺参(Apostichopus japonicus)俗称刺参,是我国主要的棘皮动物经济种类,然而迄今尚未见对其生殖系起源和性腺发生的研究报道。本文采用同源克隆策略和cDNA末端快速扩增(RACE)技术,克隆了刺参Aj-vasa全长cDNA序列,对其进行了序列特征和时空表达分析,并以Aj-vasa mRNA为标记,研究了刺参原生殖细胞的起源;进一步采用组织学技术,观察了刺参性腺的早期发生。克隆得到的Aj-vasa基因cDNA序列全长2167 bp,含有开放阅读框1593 bp,编码530个氨基酸。5′非翻译区(UTR)为449 bp,3′UTR为125 bp。推导的氨基酸序列具有DEAD-box家族蛋白的全部9个保守结构域以及GG重复序列。同时在该基因的蛋白序列中还发现了ARKF框,该框只在DEAD-box家族VASA和PL10蛋白中保守存在,而在其他亚家族中并未发现。同源性比对和进化分析显示该基因编码蛋白与其他物种的VASA相关蛋白具有较高的相似性,证明VASA蛋白在进化上高度保守。蛋白三维结构预测蛋白功能显示该蛋白Aj-VASA具备了DEAD-box家族蛋白RNA连接,ATP酶和解旋酶的功能。半定量RT-PCR分析显示,Aj-vasa基因在成体性腺组织中特异表达;原位杂交结果表明Aj-vasa mRNA主要在精原、精母细胞和卵母细胞的胞质中表达显著,推测该基因可能参与刺参两性配子的发生。胚胎和幼虫半定量RT-PCR分析检测到从未受精卵到耳状幼虫都含有Aj-vasa mRNA。表达量自未受精卵至囊胚期逐渐升高,原肠胚至耳状幼虫表达量逐渐降低。整体原位杂交结果显示:从未受精卵到囊胚期,Aj-vasa mRNA在各细胞胞质中均有分布,原肠胚阶段Aj-vasa阳性细胞集中在内、中胚层处,小耳状幼虫阶段阳性细胞分布在消化道及水体腔囊处,随后出现在水体腔及左右体腔处,并在樽形幼虫及五触手幼虫期分布在身体左右两侧的球状体处,到稚参期,强阳性信号前移至身体前端,到1mm幼参期,表达Aj-vasa的细胞已集中于背系膜处,这些细胞即为原始生殖细胞。对1mm至3cm的幼参进行石蜡切片,结果显示:1~3mm幼参中,原始生殖细胞数个集群被包在背系膜处,形成性腺原基;5mm幼参性腺原基中开始出现空腔,具有了性腺雏形;至3cm幼参,性腺开始出现分支,其形态接近成体性腺形态。
摘要第4-6页
Abstract第6-7页
第一章 前言第11-35页
    1 生殖系的起源和分化第11-20页
        1.1 原生殖细胞第12-14页
        1.2 配子的发生第14-18页
        1.3 生殖腺的发生及结构类型第18-20页
    2 vasa基因第20-25页
        2.1 vasa基因的研究简介第20-24页
        2.2 vasa基因的研究意义第24-25页
    3 刺参生殖和发育相关研究第25-34页
        3.1 刺参基础生物学特性第25-26页
        3.2 刺参的胚胎及个体发育第26-29页
        3.3 刺参生殖和发育相关研究概况第29-32页
        3.4 棘皮动物中生殖系分化和性腺发生的研究进展第32-34页
    4 本研究立体的必要性第34-35页
第二章 刺参Aj-vasa全长cDNA序列的克隆和序列特征分析第35-50页
    1 材料第36页
    2 实验方法第36-42页
        2.1 总RNA的提取和纯化第36-37页
        2.2 cDNA第一链的合成第37-38页
        2.3 目的片段的PCR扩增与克隆测序第38-40页
        2.4 RACE-PCR技术获得vasa基因全长cDNA序列第40-42页
        2.5 序列及系统进化分析第42页
        2.6 蛋白三维结构预测第42页
    3 结果第42-48页
        3.1 总RNA的提取第42-43页
        3.2 vasa基因全长cDNA的克隆策略第43页
        3.3 Aj-vasa基因的核苷酸序列特征第43-44页
        3.4 Aj-vasa基因的氨基酸序列特征第44-45页
        3.5 序列比对和系统进化分析第45-47页
        3.6 Aj-VASA蛋白三维结构特征第47-48页
    4 讨论第48-50页
第三章 Aj-vasa mRNA在性腺中的表达分析第50-63页
    1 材料第50-51页
    2 方法第51-57页
        2.1 组织半定量RT-PCR方法第51-52页
        2.2 原位杂交方法第52-57页
    3 结果第57-61页
        3.1 18S rRNA部分cDNA片段的克隆第57页
        3.2 Aj-vasa mRNA在成体组织中的RT-PCR表达分析第57-58页
        3.3 Aj-vasa mRNA在性腺中的定位第58-61页
    4 讨论第61-63页
        4.1 Aj-vasa基因在生殖细胞系中特异性表达第61-62页
        4.2 Aj-vasa基因可能参与配子发生过程第62-63页
第四章 Aj-vasa基因的发育表达图式第63-71页
    1 材料第63-64页
    2 方法第64-65页
        2.1 胚胎的半定量RT-PCR方法第64页
        2.2 胚胎整体原位杂交第64-65页
        2.3 杂交后样品组织学分析第65页
    3 结果第65-69页
        3.1 Aj-vasa基因在胚胎发育中的RT-PCR表达分析第65-66页
        3.2 原位杂交技术检测Aj-vasa基因在刺参不同发育时期的时空表达第66-69页
    4 讨论第69-71页
第五章 刺参性腺发生和分化的细胞学观察第71-77页
    1 材料第71页
    2 方法第71-72页
    3.结果第72页
    4 讨论第72-77页
结语第77-78页
参考文献第78-87页
已完成论文第87-88页
致谢第88页
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