研究背景骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）是骨髓非造血组织中的一类多潜能成体干细胞,其具有高度的可塑性和多向分化潜能,在体外具有高度的扩增能力,并可被诱导分化为骨、软骨、肌肉、脂肪和神经等组织细胞,由于避免了胚胎干细胞在伦理、道德、法律等方面的限制,目前MSCs成为组织工程和再生医学中理想的供体细胞。而且,MSCs易于外源基因的转染和表达、极好的迁移能力（migratory ability）和肿瘤趋向性（tropism）、低免疫原性的特点,使其成为肿瘤基因治疗和靶向治疗的理想载体细胞。然而随着近年来对MSCs生理特性和肿瘤研究的不断深入,有研究发现MSCs本身可能与肿瘤发生、发展之间存在着密切的关系,提示MSCs应用的生物安全性问题值得关注。我们在前期的工作中,已经初步观察到将培养的自体MSCs回输到已经发生的VX2膀胱肿瘤组织后,能够促进肿瘤的生长,并发现MSCs在体外、体内肿瘤局部微环境可以分化为肌纤维母细胞。因此,MSCs来源的肌纤维母细胞或其他间质细胞可能参与了肿瘤间质重构,而肿瘤间质重构（remodeling）是肿瘤生长发展与侵袭的关键步骤。本部分研究我们拟通过体外扩增新西兰兔MSCs后,膀胱粘膜下接种不同比例的自体MSCs和VX2肿瘤细胞混合液,观察不同数量的MSCs对膀胱VX2肿瘤发生、发展的影响,进一步研究MSCs与VX2膀胱肿瘤发生发展的关系;同时,监测MSCs对肿瘤组织某些生长因子和间质重构蛋白的表达的影响,藉此研究MSCs来源的间质细胞与肿瘤细胞间相互作用的具体信号机制。目的探讨MSCs对VX2膀胱肿瘤发生、发展的影响;研究MSCs对肿瘤组织某些生长因子和间质重构蛋白的表达的影响,证实MSCs是否参与了实体肿瘤的间质重构。方法1.兔骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定:雄性新西兰大白兔30只,每只动物均行胫骨近端骨髓穿刺抽取骨髓MSCs,体外密度梯度离心法联合细胞贴壁法分离培养扩增新西兰兔MSCs,形态学、流式细胞技术检测表面抗原等方法鉴定扩增的MSCs。2.兔VX2膀胱肿瘤模型的建立及监测:MSCs培养成功后,制备VX2肿瘤细胞悬液,将DAPI标记的自体骨髓MSCs细胞悬液和VX2肿瘤细胞细胞悬液混合,制备一总体积为介质为300μl PBS的混合细胞悬液,行膀胱粘膜下接种,按照两种细胞比例的不同,30只新西兰大白兔按照随机原则分为3组,每组10只,具体如下:A组（106VX2）,B组[（VX2/MSCs=1:1）:106VX2+106 MSCs],C组[（VX2/MSC=1:10）:106VX2+107 MSCs]。细胞膀胱粘膜下接种建立膀胱肿瘤模型,于第3、4、5、6、7、14、21、28d分别行膀胱超声多切面扫查一次,记录肿瘤最长最短直径,建立生长曲线,比较各组生长速率差异。第4周处死所有动物,取出膀胱肿瘤标本,同时记录各组远处转移情况。3.免疫组织化学（IHC）测定各组肿瘤组织中的间质重构因子和蛋白:IHC测定各组肿瘤组织生长因子（TGFβ1、bFGF、HGF）和基质重构蛋白酶（MMP2、MMP9）的表达差异,应用Image Pro Plus 5.0数字图像分析软件计算平均积分光密度（intergrated optical density,IOD）,对免疫组化（IHC）强度进行半定量分析,以IOD值代表蛋白的表达水平。从而探讨MSCs对肿瘤组织生长因子和MMPs表达的影响。4.实时荧光定量PCR监测上述生长因子和基质重构蛋白酶mRNA:应用SYBRGreenⅠ法Real-time PCR测定各组肿瘤组织上述生长因子和基质蛋白酶,数据分析采用2-ΔCtΔCt法。结果1.体外培养的MSCs形态均匀,生长曲线显示增长能力强,经鉴定为兔MSCs,而非造血系细胞。2.MSCs对VX2膀胱肿瘤发生发展的影响:细胞接种后第5天,A、B、C组分别有2（2/10）、2（2/10）、6（6/10）只动物超声检查能够监测到接种部位肿瘤生长。接种第6天三组分别有6（6/10）、7（7/10）、8（8/10）只能够监测到肿瘤生长。在第一、二、三周时间点时三组动物肿瘤体积A组＜B组＜C组,差异有统计学意义（P均＜0.001）,生长曲线提示,MSCs能够促进VX2膀胱肿瘤的发展。第四周时A、B、C三组生成膀胱肿瘤的质量分别为4.0±1.2g、11.3±3.5g、12.8±3.9g,B、C组大于A组,差异均有统计学意义（P＜0.05）。A组实验动物前三周均未出现腹股沟淋巴结转移,第四周时有3只（3/10）新西兰兔出现腹股沟淋巴结转移的情况;B组实验动物前两周未出现腹股沟淋巴结转移,第三周时3只（3/10）动物出现沟淋巴结转移,而第四周时共7只（7/10）出现淋巴结转移;C组实验动物第三周5只（5/10）动物出现腹股沟淋巴结,第四周时共8（8/10）只出现淋巴结转移。三组动物第四周处死解剖后均能发现膀胱肿瘤存在,生成的肿瘤大致呈圆形,形态较规则,无明显子灶形成。病理HE染色显示符合移植性VX2肿瘤的一般特点。3.肿瘤组织中生长因子和间质重构蛋白酶IHC测定结果:生长因子:间质细胞（成纤维细胞、内皮细胞、炎性细胞等）和肿瘤细胞（胞核、胞浆）均有阳性表达。B组TGFβ1、bFGF、HGF免疫组化IOD值水平（依次为15396.10±3230.57、9280.66±3754.99、13203.17±3990.86）显著高于A组（依次为8948.70±2462.91、5632.70±1943.18、7824.43±4077.94）,P均＜0.05;C组TGFβ1、bFGF、HGF免疫组化IOD值水平依次为20875.40±6737.11、13811.14±4311.62、14523.69±3865.41,分别高于A组,P均＜0.05,且其中TGFβ1、bFGF的IOD值高于B组,差异有统计学意义（P＜0.05）;基质金属蛋白酶:阳性表达主要分布于间质细胞（成纤维细胞、内皮细胞、炎性细胞等）和肿瘤细胞胞膜、胞浆,尤其以肿瘤浸润活跃处为著。MMP2免疫组化IOD值在A、B、C三组依次为25337.20±8151.51、51507.50±17679.55、61535.66±19449.11,B、C组高于A组,差异有统计学意义（P＜0.05）,B、C组差异无统计学意义（P=0.231）:MMP9免疫组化IOD值在A、B、C三组依次为34172.91±5243.75、60582.28±22975.45、90287.45±31362.21,B、C组高于A组,差异有统计学意义（P＜0.05）,C组高于B组,差异有统计学意义（P=0.024）。4.肿瘤组织中生长因子和间质重构蛋白酶mRNA水平:生长因子:B组TGFβ1、bFGF、HGF mRNA表达水平（依次为3.250±0.587、2.970±0.490、2.101±0.527）显著高于A组（依次为为1.087±0.194、1.134±0.165、1.185±0.247）,P均＜0.05;C组TGFβ1、bFGF、HGF mRNA表达水平依次为3.620±0.670、3.651±0.744、3.052±0.438,分别高于A组,P均＜0.05,其中C组bFGF、HGF mRNA表达高于B组,且差异有统计学意义（P＜0.05）。基质金属蛋白酶:MMP2 mRNA表达水平在A、B、C三组依次为1.134±0.243、3.67±0.945、3.845±1.159,B、C高于A组,差异有统计学意义（P＜0.05）:MMP9mRNA表达水平在A、B、C三组依次为0.955±0.166、3.360±0.628、4.045±1.084,依次升高,各组间差异均有统计学意义,P均＜0.05。结论1.VX2肿瘤细胞悬液膀胱粘膜下接种建立膀胱肿瘤模型具有量化、均一、稳定的特点,并且能够反映膀胱肿瘤的发生发展过程。2.骨髓MSCs在体内膀胱微环境下能够促进VX2实体肿瘤的发生发展。3.骨髓MSCs能够诱导肿瘤微环境高表达某些生长因子,并且可能是MSCs在肿瘤局部促进肿瘤生长的基础机制。4.骨髓MSCs胞能够促进肿瘤间质某些基质蛋白酶（MMPs）表达,可能是其促进肿瘤间质重构和侵袭转移的机制之一。目的以标准的经尿道膀胱肿瘤电切（Transurethral Electroresection of BladderTumor,TURBT）作为对照,对钬激光治疗非肌层浸润性膀胱肿瘤（Holmium LaserResection of Bladder Tumor,HOLRBT）的临床治疗效果与安全性进行评价。方法收集212例原发性非肌层浸润性膀胱肿瘤的患者资料,按照所接受的手术方式不同将其分为两组（HOLRBT组和TURBT组）。同时,将每组患者按照复发风险（EAU 2002）的不同,分为低、中、高危非浸润性膀胱肿瘤三个亚组。总结两组患者临床及病理资料,对两组手术时间、闭孔神经反射及膀胱穿孔发生率、术后需要膀胱冲洗的患者比例、留置导尿管时间、术后住院时间等指标进行比较,从而对其手术安全性进行评价;通过Kaplan-Meier分析和Log-rank检验比较两组患者整体上及各个亚组间的无复发生存情况（Recurrence-Free Survival,RFS）,基于与TURBT的比较,评价HOLRBT的临床治疗效果。结果两组患者的一般资料与病理特点差异无统计学意义（P＞0.05）,HOLRBT组与TURBT组的手术时间分别为30.69 min±16.10 min、24.90 min±14.44 min。HOLRBT组无闭孔神经反射发生,而TURBT组7（7/111）例发生闭孔神经反射,术后需要膀胱冲洗的患者比例（P=0.038）、留置尿管时间和术后住院时间均小于TURBT组（P＜0.01）。平均随访时间34 mon,Kaplan-Meier统计分析揭示HOLRBT组与TURBT整体相比,RFS差异无统计学意义（P=0.283）。经过复发危险度分层校正后,低危、中危、高危亚组内,两种手术方式的RFS相比,差异均无统计学意义,三个亚组内相关的P值依次为0.816、0.352、0.592（P＞0.05）。结论钬激光切除治疗非肌层浸润性膀胱肿瘤的近期复发率（100%-RFS）与经尿道膀胱肿瘤电切相近,但在控制术中出血及闭孔神经反射,缩短术后留置尿管时间和膀胱冲洗时间方面更有优势。
