1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus, T1DM),又称胰岛素依赖性糖尿病,是一种由自身反应性T淋巴细胞介导的以胰腺p细胞进行性损伤和胰岛素分泌绝对不足为主要特征的自身免疫性疾病。在T1DM发病初期,活化的自身反应性T淋巴细胞、巨噬细胞等免疫细胞大量浸润胰岛,其释放出的炎性介质,如Thl型细胞因子和NO等发挥协同作用,引起胰腺p细胞凋亡、坏死以及胰岛素分泌异常等,进而导致高血糖症状和其他T1DM并发症的发生。目前常用的1型糖尿病治疗方法或多或少地均存在一定的不足,研究者们一直在致力于寻找更为安全有效的1型糖尿病治疗方法。随着分子生物学技术的不断发展,基因治疗技术方兴未艾,为1型糖尿病新型治疗方法的研究开辟了一个崭新的领域。胰岛素原是1型糖尿病发病过程中唯一的p细胞特异性、原发性自身抗原,在驱动自身免疫性p细胞损伤过程中发挥着重要的作用,它也是诱导免疫耐受的主要抗原。胰腺再生基因Ⅲ(RegⅢ)是介导胰岛β细胞再生的关键基因,它能够刺激胰腺导管上皮细胞转化为β细胞,在促进胰岛组织再生过程中起着重要的作用。本研究选择作用于1型糖尿病发病过程中两个不同环节的关键靶点——胰岛素原和RegⅢ基因,利用基因重组技术将其整合到含有双启动子的pBudCE4.1真核表达载体上,以构建含有RegⅢ和胰岛素原的双基因质粒pReg/PI;并通过一系列体外实验观察pReg/PI质粒在真核细胞中的表达情况以及其对胰岛β细胞株NIT-1细胞的作用;建立链脲佐菌素(STZ)诱导的1型糖尿病小鼠模型,肌肉注射给予pReg/PI质粒进行治疗,观察pReg/PI双基因质粒对1型糖尿病小鼠的治疗作用并初步探讨其作用机制。首先,我们利用RT-PCR技术从Balb/c小鼠基因组中调取胰岛素原cDNA序列、双酶切反应从pCMV-RegⅢ质粒中获取RegⅢcDNA序列,利用基因重组技术将RegⅢcDNA和胰岛素原cDNA分别插入空质粒载体pBudCE4.1所含的两个启动子下游的多克隆位点中,以构建pReg/PI双基因质粒。琼脂糖凝胶电泳和基因测序结果表明,RegⅢcDNA和胰岛素原cDNA均成功插入pBudCE4.1质粒载体,插入方向正确,基因序列中未有点突变和读码框移发生,pReg/PI双基因质粒构建成功。其次,我们采用脂质体转染法将pReg/PI质粒转染cos-7细胞和NIT-1细胞,利用western blot技术检测了RegⅢ蛋白和胰岛素原在真核细胞中的表达情况,结果表明,pReg/PI质粒能够在真核细胞中高效地表达胰岛素原和RegⅢ蛋白；通过流式细胞技术和MTT法研究了pReg/PI质粒转染后对NIT-1细胞增殖、高糖或细胞毒性T细胞反应诱导的NIT-1细胞凋亡的影响,我们发现pReg/PI质粒转染后能够促进NIT-1细胞的增殖,抑制细胞毒性T淋巴细胞对NIT-1细胞的损伤反应,但是对高糖诱导的NIT-1细胞的凋亡并无明显的改善作用。最后,我们采用小剂量腹腔注射STZ的方法建立1型糖尿病动物模型,肌肉注射给予pReg/PI质粒治疗5周,通过监测小鼠血糖的变化来观察pReg/PI质粒改善1型糖尿病症状的作用。我们发现在造模初期给予pReg/PI质粒治疗5周可明显降低糖尿病小鼠的血糖并延缓1型糖尿病的发病时间。为了进一步探讨pReg/PI质粒干预治疗1型糖尿病的作用机制,我们对1型糖尿病小鼠的胰腺进行了病理组织学分析、采用Tunel法原位检测了胰岛中细胞的凋亡情况并利用western blot技术检测了凋亡相关蛋白NF-κB和Bcl-2的表达情况、MTT法检测脾淋巴细胞的增殖反应、FACS法检测了小鼠体内CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的分化情况、酶联免疫法分析了糖尿病小鼠血清中胰岛素、细胞因子(IL-2、IL-10、IFN-γ和TGF-β)分泌的改变。结果表明,给予pReg/PI质粒进行治疗能够抑制糖尿病小鼠的脾淋巴细胞增殖反应、减少胰岛淋巴细胞的浸润并改善胰腺炎症状,通过减少促凋亡因子NF-κB的表达来抑制胰岛细胞的凋亡、促进体内CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞分化和胰岛素的分泌、恢复体内Th1/Th2反应的平衡状态。总之,pReg/PI双基因质粒能够在体外真核细胞中进行高效表达,促进胰岛p细胞株NIT-1细胞的增殖,并抑制由免疫相关因素引起的NIT-1细胞的凋亡；在体内,pReg/PI质粒能够通过诱导重建机体的免疫耐受状态和促进胰腺β细胞再生的机制来发挥改善1型糖尿病症状的作用。
