目的：(1)建立脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)体外培养的方法并探讨姜黄素对HUVECs增殖的影响。(2)探讨姜黄素抑制HUVECs中microRNAs的差异表达谱,验证在姜黄素抑制HUVECs中显著差异表达的microRNAs。方法：(1)采用0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA消化、分离、体外原代培养及消化传代脐静脉血管内皮细胞,简化完全培养液组分(不添加血管内皮细胞生长因子、肝素等辅助因子),当原代培养细胞80%以上汇合,根据细胞特有的形态学特征和Ⅷ因子进行内皮细胞的鉴定。然后用不同浓度姜黄素(20、40、80、160μmol/l)处理内皮细胞不同时间(0、24h、48h、72h、96h),MTT法测定姜黄素对HUVECs增殖的影响。(2)采用GeneChip(?)microRNA 2.0芯片技术,将对照组和姜黄素(40μmol/1)组的microRNAs进行对比,根据统计学的方法分析芯片实验数据,筛选出共同差异表达的microRNAs。采用实时荧光定量PCR的方法,分别验证这些microRNAs的差异表达情况。将芯片和实时荧光定量PCR两种方法一致的microRNAs确定为有意义的共同差异表达的microRNAs,并通过生物信息学方法预测差异显著的microRNA的靶基因。结果：种植在培养瓶中的内皮细胞2h贴壁生长,24h换液后内皮细胞80%融合,细胞状态好,内皮细胞呈单层铺路石样外观,经过镜下观察和Ⅷ因子相关抗原鉴定证明是脐静脉血管内皮细胞。姜黄素呈浓度依赖性和时间依赖性抑制HUVECs的增殖。(2)姜黄素(40μmol/l)处理HUVECs24h后,芯片结果显示和对照组相比,姜黄素药物组表达谱有30个microRNAs明显变化,其中11个microRNA表达上调,19个microRNA表达下调；实时荧光定量PCR证实mi-1275、mi-3127和mi-1246表达显著升高,生物信息学分析结果显示,这些表达差异的microRNAs可以调控与新生血管相关的基因的表达,如mi-1275可能靶向VEGFb等。结论：(1)用胰蛋白酶灌注脐静脉是一种简单、实用的获得人脐静脉血管内皮细胞的方法,可靠性大,成功率高,可以构建体外研究血管内皮细胞的模型。本研究在成功建立HUVECs体外培养方法的基础上,建立了姜黄素抑制HUVEC增殖的模型；(2)运用microRNA芯片技术,首次发现姜黄素抑制血管内皮细胞中mi-1275、mi-3127和mi-1246的表达明显增多,其中mi-1275在姜黄素抑制HUVECs中可能是通过抑制其靶基因的表达而介导的,这为进一步研究microRNA在姜黄素抗角膜新生血管中的作用创造了条件。
