苹果果胶多糖和果胶寡糖的分离纯化及其活性研究

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本文以陕西礼泉产红富士苹果果皮为原料,利用水、草酸铵、HCl和KOH系列提取的方法从苹果皮中提取出四种性质有所差异的果胶多糖,对果胶酶解后产生的寡糖混合物进行了分离纯化,得到的寡糖单体进行ESI-MS分析,并且对果胶多糖以及寡聚半乳糖醛酸的部分活性进行了研究,主要结果如下:1.苹果果胶多糖的理化性质及其活性研究用水、0.5%草酸铵溶液、0.05M盐酸溶液、1M KOH溶液从苹果皮中连续提取得到四种果胶多糖,分别是水溶性果胶多糖(WSP)、盐溶性果胶多糖(CSP)、酸溶性果胶多糖(ASP)和碱溶性果胶多糖(BSP),每种组分的得率分别为3.49%(WSP)、5.23%(CSP)、2.77%(ASP)、2.35%(BSP);气相色谱测定果胶的单糖组成及其比例分别是:WSP(Rha:Ara:Xyl:Glc:Gal:GalA=1.51:58.5:2.13:19.51:11.88:6.44), CSP(Ara:Glc:Gal:GalA=54.61:9.81:13.43:22.16), ASP(Rha:Ara:Xyl:Glc:Gal:GalA=1.11:23.28:1.4:16.51:14.14:13.56), BSP(Rha:Ara:Xyl:Glc:Gal=3.15:28.33:4.51:49.70:14.32);苯酚-硫酸法测定四种果胶的总糖含量WSP为85.00%、CSP为96.20%、ASP为83.48%、BSP为80.15%;咔唑硫酸法测定四种果胶的糖醛酸含量CSP为24.5%,ASP为15.7%,WSP为7.3%,BSP不含半乳糖醛酸;Bradford法测定四种果胶的蛋白含量WSP为2.58%, CSP为0.41%,ASP为1.48%,BSP为6.45%;HPGCP法测定四种果胶的相对分子量都大于4.0×105Da; MTT比色法测定四种果胶在不同浓度下对HT-29细胞的增殖都有一定的抑制作用。2.CSP寡糖混合物的制备及分离纯化CSP经脱脂化得到果胶酸,对果胶酸的酶解条件进行了优化,最终确定最佳酶解条件:酶浓度0.50mg·mL-1,酶解时间60min,温度40℃,pH4.5。酶解后得到聚合度为1~11的酸性寡糖混合物和聚合度为1~9的中性寡糖混合物,分别使用强阴离子交换树脂和Bio-Gel-P4对寡糖混合物进行分离,得到聚合度为1~7的半乳糖醛酸单体和聚合度为1~4的中性糖。一次上样500mg果胶酸的酶解混合物可以制备得到390mg左右的糖醛酸单体和10mg左右的中性糖单体,.并且对这些寡糖单体进行了ESI-MS分析。3.寡聚半乳糖醛酸对肿瘤细胞增殖的影响本试验利用MTT比色法检测分离制备得到的四种寡聚半乳糖醛酸的抗肿瘤活性,经研究发现几种酸性寡糖对A549、HT-29、H1299、LoVo四种肿瘤细胞株都具有很好的抑制肿瘤细胞增殖的作用,而且在不同的细胞中效果不一,表现出一定的剂量依赖性,在合适的浓度时抑制肿瘤细胞的作用与阴性对照5-FU的作用相当。4.寡聚半乳糖醛酸对小鼠脾细胞增殖反应的影响通过3H-TdR掺入的方法检测不同浓度、不同聚合度的寡聚半乳糖醛酸样品、寡聚半乳糖醛酸与Con A和LPS丝裂原联用对脾细胞增殖的影响作用,经检测发现,单独使用各个聚合度的糖醛酸,在浓度较低时能够明显的促进小鼠脾细胞的增殖,但是当浓度逐渐增大时,这种促进作用就会减弱,甚至抑制小鼠的脾细胞增殖;当糖醛酸与Con A联用时,DP2、DP4、DP6这三种酸性寡糖表现出与Con A的协同作用,DP3、DP5与Con A合用后并没有表现出协同作用;半乳糖醛酸与LPS丝裂原联用,对小鼠脾细胞的促增殖作用都明显低于单独使用LPS丝裂原。
摘要第3-5页
Abstract第5-6页
第一章 绪论第12-26页
    1.1 糖类物质的研究进展第12页
    1.2 果胶多糖的研究进展第12-19页
        1.2.1 果胶多糖的来源及其分类第13-14页
            1.2.1.1 果胶的分类第13页
            1.2.1.2 果胶的来源第13-14页
        1.2.2 果胶多糖的分子结构和化学组成第14-16页
        1.2.3 果胶多糖的提取第16-18页
            1.2.3.1 酸萃取法第16-17页
            1.2.3.2 碱萃取法第17页
            1.2.3.3 草酸铵提取法第17-18页
            1.2.3.4 微生物酶法第18页
        1.2.4 果胶多糖的应用研究第18-19页
            1.2.4.1 果胶在食品工业中的应用第18-19页
            1.2.4.2 果胶在医药行业的应用第19页
    1.3 寡聚半乳糖醛酸的研究进展第19-24页
        1.3.1 寡聚糖醛酸的化学结构第19-20页
        1.3.2 寡聚半乳糖醛酸的来源第20-21页
            1.3.2.1 从天然植物中提取第20页
            1.3.2.2 化学合成法第20页
            1.3.2.3 酶法降解制备寡聚半乳糖醛酸第20-21页
        1.3.3 寡聚半乳糖醛酸的分离第21页
        1.3.4 寡聚半乳糖醛酸的检测方法第21-23页
            1.3.4.1 薄层层析法(thin-layer chromatography,TLC)第21-22页
            1.3.4.2 气相色谱法(gas chromatography,GC)第22页
            1.3.4.3 脉冲安培检测法(HPAEC-PAD)第22页
            1.3.4.4 质谱(Mass spectrometry,MS)第22-23页
            1.3.4.5 红外光谱(IR)第23页
        1.3.5 寡聚半乳糖醛酸的生物活性第23-24页
            1.3.5.1 寡聚半乳糖醛酸作为诱导子第23-24页
            1.3.5.2 寡聚半乳糖醛酸调节植物的生长发育第24页
    1.4 研究的目的意义第24-26页
第二章 苹果果胶多糖的理化性质以及抑制HT-29细胞增殖活性的初步研究第26-44页
    2.1 实验部分第26-31页
        2.1.1 实验材料与试剂第26页
        2.1.2 实验仪器与设备第26页
        2.1.3 实验方法第26-31页
            2.1.3.1 苹果果胶多糖的提取第26-27页
            2.1.3.2 四种果胶多糖的糖组成分析第27-28页
            2.1.3.3 果胶多糖的总糖含量测定第28页
            2.1.3.4 果胶多糖的糖醛酸含量测定第28-29页
            2.1.3.5 果胶多糖的蛋白含量测定第29页
            2.1.3.6 果胶多糖的分子量测定第29-30页
            2.1.3.7 果胶多糖的红外(IR)分析第30页
            2.1.3.8 果胶多糖对HT-29细胞增殖的抑制作用第30-31页
    2.2 实验结果与分析第31-42页
        2.2.1 果胶多糖的提取第31页
        2.2.2 果胶多糖的单糖组成分析第31-33页
        2.2.3 果胶多糖的总糖含量测定第33-34页
        2.2.4 果胶多糖的糖醛酸含量测定第34-35页
        2.2.5 蛋白含量测定第35-36页
        2.2.6 果胶多糖的分子量测定第36-38页
        2.2.7 果胶多糖的红外分析第38-40页
        2.2.8 果胶多糖抑制HT-29细胞增殖的活性第40-42页
    2.3 小结第42-44页
第三章 苹果果胶多糖CSP中寡糖的分离纯化第44-57页
    3.1 实验部分第44-47页
        3.1.1 实验材料与试剂第44页
            3.1.1.1 实验材料第44页
            3.1.1.2 实验试剂第44页
        3.1.2 实验仪器与设备第44页
        3.1.3 实验方法第44-47页
            3.1.3.1 CSP的直接酶解第44-45页
            3.1.3.2 CSP果胶酸的酶解第45页
            3.1.3.3 CSP寡糖混合物的制备第45页
            3.1.3.4 CSP寡糖混合物的分离纯化第45-47页
                3.1.3.4.1 寡聚半乳糖醛酸的分离纯化及制备第45-46页
                3.1.3.4.2 寡聚半乳糖醛酸的TLC和ESI-MS检测第46-47页
                3.1.3.4.3 中性寡糖的分离纯化第47页
    3.2 实验结果分析第47-55页
        3.2.1 CSP的直接酶解第47-48页
        3.2.2 CSP果胶酸的酶解第48-49页
        3.2.3 CSP寡聚半乳糖醛酸的分离制备及ESI-MS分析第49-53页
            3.2.3.1 酸性寡糖混合物的制备及ESI-MS分析第49-50页
            3.2.3.2 CSP酸性寡糖混合物的分离第50-51页
            3.2.3.3 寡聚糖醛酸的制备及其TLC、ESI-MS分析第51-53页
        3.2.4 CSP中性寡糖混合物的分离第53-55页
            3.2.4.1 CSP中性寡糖混合物的制备及ESI-MS分析第53-54页
            3.2.4.2 中性寡糖混合物的分离纯化第54-55页
                3.2.4.2.1 聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Gel-P4)过滤色谱的分离原理第54页
                3.2.4.2.2 中性寡糖混合物的分离纯化及其ESI-MS分析第54-55页
    3.3 本章小节第55-57页
第四章 寡聚半乳糖醛酸对肿瘤细胞增殖的影响第57-66页
    4.1 实验部分第57-59页
        4.1.1 实验材料、试剂与仪器第57页
            4.1.1.1 实验材料第57页
            4.1.1.2 实验试剂第57页
            4.1.1.3 实验仪器第57页
        4.1.2 实验方法第57-59页
            4.1.2.1 溶液配制第57-58页
            4.1.2.2 细胞培养第58页
            4.1.2.3 MTT比色法测定几种肿瘤细胞的增殖抑制率第58-59页
    4.2 结果与分析第59-65页
        4.2.1 寡聚半乳糖醛酸(GalA2~GalA5)的细胞生长抑制率第59-60页
        4.2.2 不同浓度的寡聚半乳糖醛酸对四种细胞株增殖的影响第60-65页
            4.2.2.1 四种寡聚半乳糖醛酸对人肺癌细胞A549增殖的影响第60-61页
            4.2.2.2 四种寡聚半乳糖醛酸对人结肠癌细胞HT-29增殖的影响第61-62页
            4.2.2.3 四种寡聚半乳糖醛酸对人结肠癌细胞LoVo增殖的影响第62-63页
            4.2.2.4 四种寡聚半乳糖醛酸对人肺癌细胞H1299增殖的影响第63-65页
    4.3 讨论第65页
    4.4 本章小结第65-66页
第五章 寡聚半乳糖醛酸对小鼠脾细胞增殖反应的影响第66-71页
    5.1 实验部分第66-68页
        5.1.1 实验材料、试剂及仪器第66页
            5.1.1.1 实验材料第66页
            5.1.1.2 实验试剂及仪器第66页
        5.1.2 实验方法第66-68页
            5.1.2.1 体外药物(寡糖样品)的配制方式第66页
            5.1.2.2 寡聚半乳糖醛酸对正常小鼠脾淋巴细胞增殖的影响第66-68页
                5.1.2.2.1 脾细胞悬液的制备第66-67页
                5.1.2.2.2 脾细胞增殖实验第67-68页
    5.2 实验结果第68-69页
        5.2.1 各个聚合度的寡聚半乳糖醛酸对小鼠脾细胞增殖反应的影响第68页
        5.2.2 寡聚半乳糖醛酸与Con A、LPS丝裂原联用对小鼠脾细胞增殖反应对的影响第68-69页
    5.3 本章小结第69-71页
结论第71-72页
参考文献第72-79页
攻读硕士期间取得的学术成果第79-80页
致谢第80页
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