三种含氮杂环化合物对麦田土壤细菌的影响及对铜绿假单胞菌基因的调节

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本论文研究的目的旨在通过研究供试含氮杂环化合物对麦田土壤细菌多样性的影响及对铜绿假单胞菌基因的调节作用,从分子生物学的角度对农药影响环境中微生物生态及微生物对农药的降解做出有益的研究和探索,以期能从分子水平上了解、分析农药与微生物的关系,为新农药的创制提供实验室条件下进行环境评测的有效手段。在前期工作的基础上,对未见其他文献报道的两种含氮杂环化合物:4-[2-(4,6-二甲氧基嘧啶基)]-3-硫代脲酸苯酯和4-氨基-6-特丁基-3-甲硫基-1,2,4-三嗪-5(4H)-酮硫酸盐的合成工艺路线进行研究,使之产物收率高并且操作简便,安全。生物活性实验表明这两种含氮杂环化合物具有良好生物活性,极有可能创制成为具有我国自主知识产权的农药品种。传统的平板培养技术和荧光标记末端限制性片段长度多态性分析技术相结合,对三种供试含氮杂环化合物:4-氨基-6-特丁基-3-甲硫基-1,2,4-三嗪-5(4H)-酮硫酸盐;N-(4,6-二甲基嘧啶-2-基)苯胺;4-[2-(4,6-二甲氧基嘧啶基)]-3-硫代脲酸苯酯进行麦田土壤细菌多样性的研究。结果表明这三种含氮杂环化合物对土壤细菌的负面影响均较小,并且容易诱导出相应的抗性菌株,生物相容性良好。将传统方法和分子生物学手段相结合,使得实验数据更加丰富、准确和可靠,是一种对农药影响微生态判断的有效方法。首次将以质粒pMS402为载体构建的铜绿假单胞菌PAO1的随机启动子库应用于农药研究过程的筛选。通过对4-氨基-6-特丁基-3-甲硫基-1,2,4-三嗪-5(4H)-酮硫酸盐,N-(4,6-二甲基嘧啶-2-基)苯胺和3-乙基-N-(4-氟代苯甲叉)-5-甲基-4H-1,2,4-三唑-4-胺三种能被铜绿假单胞菌降解的含氮杂环化合物高通量的全库筛选,共获得了7个与供试化合物降解有关的铜绿假单胞菌启动子。通过测序、分析、比对后作出各启动子的基因图谱,并对其各自的功能进行初步的判定,其中两个基因的功能比较明确,一个为乙酰辅酶A脱氢激酶,一个是磷酸转移酶,其他的基因可能与转运系统组成蛋白、膜相关蛋白、氧化还原蛋白及双组分调节子等有密切关系。这一方法的应用,同时也为研究微生物对农药降解提供了新的思路和方法。
摘要第3-4页
Abstract第4-5页
第一章 绪论第9-21页
    1.1 农药的发展第9-10页
    1.2 农药的种类第10-11页
    1.3 农药的作用第11-12页
    1.4 农药造成的危害第12-17页
        1.4.1 对环境造成了广泛的污染第12-13页
        1.4.2 对人类身体构成的危害第13-17页
    1.5 现代农药的发展第17-20页
        1.5.1 历史背景第17页
        1.5.2 农药的发展方向第17-18页
        1.5.3 新型农药的开发第18-20页
    1.6 本文研究的目的和内容第20-21页
第二章 两种含氮杂环化合物的合成工艺与生物活性的研究第21-37页
    2.1 引言第21-28页
        2.1.1 我国的农药发展第21-22页
        2.1.2 绿色农药第22-23页
        2.1.3 生物农药和化学合成农药第23页
        2.1.4 新农药的创制途径第23-24页
        2.1.5 绿色合成农药的主要研究内容第24-27页
        2.1.6 本实验的研究内容第27-28页
    2.2 实验部分第28-30页
        2.2.1 仪器与试剂第28页
        2.2.2 实验方法第28-30页
    2.3 结果与讨论第30-37页
        2.3.1 4-[2-(4,6-二甲氧基嘧啶基)]-3-硫代脲酸苯酯的合成工艺及生物活性研究第30-33页
        2.3.2 4-氨基-6-特丁基-3-甲硫基-1,2,4-三嗪-5(4H)-酮硫酸盐的合成工艺及生物活性研究第33-36页
        2.3.3 本章结论第36-37页
第三章 三种含氮杂环化合物对麦田土壤细菌的影响第37-67页
    3.1 引言第37-47页
        3.1.1 土壤微生物的研究进展第38-40页
        3.1.2 土壤微生态的主要研究方法第40-45页
        3.1.3 微生物多样性的研究第45-46页
        3.1.4 本实验的研究内容第46-47页
    3.2 实验材料第47-49页
        3.2.1 实验药品第47页
        3.2.2 实验仪器第47-48页
        3.2.3 土壤样品第48页
        3.2.4 实验所用供试化合物第48-49页
    3.3 实验方法第49-52页
        3.3.1 土壤样品的处理第49页
        3.3.2 可培养异养细菌的形态学观察第49页
        3.3.3 土壤样品的DNA提取,纯化及PCR扩增第49-52页
        3.3.4 末端片断长度分析及样品间相似度计算第52页
        3.3.5 可培养的异养细菌多样性的统计学分析第52页
    3.4 结果与讨论第52-67页
        3.4.1 土壤中微生物DNA的提取及PCR扩增第52-53页
        3.4.2 4-氨基-6-特丁基-3-甲硫基-1,2,4-三嗦-5(4H)-酮硫酸盐处理组实验结果第53-58页
        3.4.3 N-(4,6-二甲基啥吮-2-基)苯胺处理组实验结果第58-62页
        3.3.4 4-[2-(4,6-二甲氧基啥唆基)]-3-硫代服酸苯醋处理组实验结果第62-66页
        3.4.5 本章小结第66-67页
第四章 三种含氮杂环化合物对铜绿假单胞菌基因的调节第67-101页
    4.1 引言第67-74页
        4.1.1 农药残留第67-68页
        4.1.2 农药的微生物降解第68页
        4.1.3 微生物降解农药的机理第68-70页
        4.1.4 降解农药的微生物类群第70-72页
        4.1.5 铜绿假单胞菌及其特性第72-73页
        4.1.6 铜绿假单胞菌随机启动子库第73-74页
        4.1.7 本实验的研究内容第74页
    4.2 实验材料第74-77页
        4.2.1 菌种、质粒及培养条件第74-75页
        4.2.2 培养基的配置第75页
        4.2.3 实验药品第75-77页
    4.3 实验方法第77-88页
        4.3.1 DNA的提取第77-79页
        4.3.2 感受态细胞的制备第79页
        4.3.3 电转化第79-80页
        4.3.4 三亲株杂交试验第80页
        4.3.5 质粒和DNA片段的酶切和连接第80-81页
        4.3.6 随机启动子库的构建方法第81-85页
        4.3.7 DNA测序和序列分析第85-86页
        4.3.8 测定铜绿假单胞菌对不同供试化合物的敏感浓度第86-87页
        4.3.9 测定敏感浓度下供试化合物对铜绿假单胞菌基因的调节第87-88页
    4.4 结果与讨论第88-101页
        4.4.1 铜绿假单胞菌随机启动子库的构建第88-89页
        4.4.2 用铁对随机启动子库的筛选验证第89-90页
        4.4.3 供试化合物的选择第90页
        4.4.4 铜绿假单胞菌对不同供试化合物的敏感浓度的测定第90-92页
        4.4.5 测定供试化合物在敏感浓度下对铜绿假单胞菌基因的调节第92-94页
        4.4.6 对筛选获得的敏感浓度的供试化合物感应基因进行测序及分析第94-100页
        4.4.7 本章小结第100-101页
结论第101-102页
参考文献第102-116页
附录第116-124页
攻读博士学位期间的科研成果第124-125页
致谢第125页
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