骨髓增生异常综合征骨髓造血细胞分化异常及其相关机制的研究

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目的对骨髓增生异常综合征(Myelodysplastic Syndrome, MDS)患者骨髓造血细胞的分化异常进行检测,并对其分化异常的部分相关机制进行研究;同时进一步寻找MDS恶性克隆细胞,并探讨其过度增殖、分化异常及凋亡逃逸等恶性特征。方法研究对象为天津医科大学总医院自2008年7月至2010年10月新诊断的MDS患者62例、MDS转化的急性髓系白血病(MDS-AML)8例、急性髓系白血病(AML)7例、病例对照组16例及正常对照32名。第一部分检测MDS患者骨髓造血细胞分化异常情况,采用流式细胞术(FCM)检测MDS患者骨髓粒系、单核系及红系分化抗原;干细胞分群;单个核细胞细胞周期分布,并分析分化异常情况与染色体恶性克隆负荷的相关性。第二部分研究导致MDS患者骨髓造血细胞分化异常的相关机制,采用FCM检测MDS患者干/祖细胞表面干细胞因子受体(SCF-R)、红细胞生成素受体(EpoR)、粒细胞集落刺激因子受体(G-CSFR)及血小板生成素受体(TpoR)的表达情况,并分析其临床意义;干/祖细胞转录因子GATA-1、GATA-2的表达情况;RT-PCR的方法检测GATA-1基因在MDS患者骨髓中的表达情况。第三部分寻找MDS恶性克隆细胞,检测MDS患者骨髓干细胞中白细胞介素-3受体α(IL-3Ra)表达情况,并探讨IL-3Ra阳性细胞的异常增殖及分化特征。结果第一部分粒系细胞分化抗原表达的模式和比例:选择CD13/CD11b CD13/CD16及CD11b/CD16组合来分析粒细胞分化抗原表达模式,对照组和病例对照组骨髓粒系细胞组合模式分别为“对钩”、“镰刀,或“反7”状,MDS患者骨髓粒系细胞发育分化中的抗原表达失去正常序贯表达模式,呈现抗原的连续性表达中断等不同程度的改变。高危组CDllb/CD11b+比值(0.32±0.29)明显高于低危组(0.16±0.23)、病例对照组(0.05±0.03)及正常对照组(0.07±0.05,P<0.01);高危组CD16/CD16+比值(1.32±0.77)明显高于病例对照组(0.33±0.32)和正常对照组(0.39±0.31,P<0.05);高危组骨髓粒细胞CD13的平均荧光强度(MFI)明显高于正常对照组(P<0.01),侧向角散射光信号(SSC)的MFI明显低于病例对照组和正常对照组(P<0.01)。高危组CD11b-HLA-DR+(4.08%±2.97%)、CD11b-HLA-DR’(14.90%±15.44%)、CD16-HLA-DR- (38.98%±21.59%)、CD11b+CD16-(32.57%±16.52%)及CD13+CD16-(43.97%±20.31%)细胞占粒细胞比例明显高于低危组、病例对照组及对照组(P<0.05),其他组间比较差异无统计学意义。单核系细胞分化抗原表达的模式和比例:选择CD13/CD16和CD11b/HLA-DR组合来分析单核细胞分化抗原表达模式,MDS患者骨髓单核系细胞发育分化中的抗原表达模式相对于对照组的序贯组合模式出现不同程度的改变。高危组CD11b-HLA-DR+(12.38%±8.97%), CD11lb+HLA-DR-(38.33%±18.43%)细胞占单核系细胞比例明显高于病例对照组和正常对照组(P<0.05)。高危组单核细胞CD14(56.74%±17.73%)表达率明显低于正常对照组,CD64的表达率各组之间比较,差异无统计学意义,CD56(32.45%±20.07%)、CD34(13.54%±13.73%)及CD7(15.31%±12.76%)表达率明显高于病例对照组及正常对照组。红系细胞分化抗原表达的模式和比例:应用CD71和血型糖蛋白A(glycophorin A,GlyA)的组合来分析红系细胞的分化,对照组和病例对照组两种抗原的组合模式均为双阳性表达,部分MDS患者可见CD71和GlyA表达不同步现象。低危组和高危组CD71+、GlyA+细胞占CD45-细胞的比例均显著低于病例对照组和正常对照组(P<0.05),CD71+GlyA+双阳性细胞分别占CD45-、CD71+细胞的比例均显著低于病例对照组和正常对照组(P<0.05), CD71+GlyA+双阳性细胞占GlyA+细胞的比显著低于正常对照组(P<0.05)。MDS患者粒系、单核系及红系抗原表达的比例和模式的异常数目与IPSS(国际预后积分系统)积分(r=0.662, P=0.000)、WPSS (WHO分型预后积分系统)积分(r=0.602,P=0.000)及恶性克隆负荷(r=0.477,P=0.001)均呈正相关。高危和MDS-AML组骨髓CD34+细胞比例(2.29%±2.17%、18.69±17.47%)明显高于对照组(0.36%±0.49%,P<0.05)。低危、高危及MDS-AML组CD34+CD38+细胞相对比例(86.09%±7.79%、81.68%±11.82%、82.88%±2.60%)显著低于对照组(92.21%±3.85%,P<0.05),而CD34+CD38-细胞比例(13.91%±7.79%、18.32%±11.82%、17.13%±2.60%)显著高于对照组(7.79%±3.85%,P<0.05)。MDS组CD34+CD38-细胞比例与IPSS (r=0.493, P=0.001)、WPSS积分(r=0.586,P=0.000)均呈正相关。CD34+CD38-细胞比例≤12.0%的MDS患者治疗有效率高于CD34+CD38-细胞比例>12.0%的患者,差异无统计学意义。低危、高危及MDS-AML组单个核细胞(BMMNC)中Go/G1期细胞比例(94.52%±4.32%,96.07%±3.88%,94.65%±4.55%)明显高于对照组(88.94%±7.30%,P<0.01),而3组患者S期(4.63%±3.34%,3.45%±3.80%,5.12%±4.55%)和G2/M期(0.84%±1.52%,0.48%±0.74%,0.22%±0.34%)细胞比例明显低于对照组(9.06%±6.50%,2.00%±2.93%,P<0.05),3组S+G2/M期细胞比例明显高于对照组(P<0.01)。第二部分MDS患者骨髓造血细胞造血因子受体及部分转录因子的检测,对照组骨髓CD34+CD38+细胞亚群EpoR表达率(18.68%±18.34%)显著低于CD34+CD38细胞亚群(63.61%±19.98%,P<0.01),两亚群之间SCF-R.G-CSFR及TpoR表达率差异无统计学意义。在CD34+CD38+细胞亚群中,3组间SCF-R和TpoR表达率差异无统计学意义,而低危组和高危组EpoR的表达率(8.30%±6.55%、7.82%±7.98%)明显低于对照组(18.68%±18.34%,P<0.05),G-CSFR的表达率(29.78%±19.14%、28.66%±21.14%)明显低于对照组(44.37%±23.43%,P<0.05);在CD34+CD38-细胞亚群中,3组间SCF-R和G-CSFR表达率差异无统计学意义,低危组和高危组EpoR的表达率(42.19%±21.87%、25.67%±15.64%)明显低于对照组(63.61%±19.98%,P<0.01),TpoR的表达率(5.42%±4.72%、4.05%±3.95%)明显低于对照组(10.13%±8.31%,P<0.05)。MDS患者骨髓CD34+CD38+和CD34+CD38-细胞亚群表面受体表达率低的患者其外周血血红蛋白水平、中性粒细胞及血小板计数减低的发生率明显高于受体表达率不低的患者(均P<0.05)。在CD34+CD38+细胞亚群中,低危组和高危组GATA-1的表达率高于对照组,差异无统计学意义,高危组GATA-2的表达率(12.47%±13.00%)明显高于对照组(5.64%±7.32%,P<0.05),余组间比较差异无统计学意义;在CD34+CD38-细胞亚群中,高危组GATA-1的表达率(28.16%±13.71%)明显高于对照组(12.76%±14.02%,P<0.05),低危组和高危组GATA-2的表达率(17.12%±10.61%、29.38%±7.71%)明显高于对照组(10.07%±9.26%,P<0.05)。GATA-1基因在高危组骨髓单个核细胞(BMMNC)中的表达量为(0.504±0.156),显著高于对照组(0.323±0.086,P<0.01),余组间比较差异无统计学意义。第三部分MDS骨髓干细胞中白细胞介素-3受体α(IL-3Rα)表达情况及IL-3Rα阳性细胞增殖及分化等特征的检测。低危组、高危组及AML组CD34+CD38细胞中CD123+细胞比例(42.48%±25.88%、51.62%±29.24%、56.19%±32.20%)明显高于对照组(9.06%±10.04%, P<0.01)。CD 123+CD34+CD38-/CD34+CD38表达率与恶性克隆负荷呈显著正相关(r=0.419,P=0.003),与MDS骨髓粒系、单核系及红系细胞分化模式和比例的异常数目呈显著正相关(r=0.462,P=0.001)。低危组、高危组及AML组CD34+CD38 CD 123+细胞中GATA.1.GATA.2及CD71表达率均明显高于其在CD34+CD38+CD123+细胞中的表达率(P<0.01);3组CD34+CD38-CD123+细胞中EpoR表达率高于其在CD34+CD38-CD123细胞中的表达率,但差异无统计学意义;3组CD34+CD38-CD123+细胞中CDllb、CD114及Annexin V表达率均明显低于其在CD34+CD38-CD123-细胞中表达率(P<0.05)。结论(1)MDS患者骨髓粒系、单核系及红系细胞抗原不同步表达,表现为阶段特异性和系别特异性的异常,诸如成熟阶段细胞异常表达幼稚细胞抗原,SSC值降低即胞质低颗粒化\脱颗粒现象、连续性表达中断、抗原部分表达降低\缺失,髓系细胞异常表达淋巴系抗原等,并且由低危向高危进展的过程中存在分化异常的积累并与IPSS、WPSS积分及恶性克隆负荷成显著正相关。这提示分化抗原检测可能有助于MDS患者的早期诊断和预后判断。(2)MDS患者原代骨髓CD34+细胞亚群分化异常,CD34+CD38-/CD34+比例增高,并和IPSS、WPSS积分呈正相关性;骨髓单个核细胞存在G1期阻滞现象,提示MDS患者造血细胞增殖分化异常,CD34+细胞亚群和细胞周期测定有助于MDS患者的辅助诊断以及疗效和预后判断。(3)MDS患者原代骨髓CD34+细胞亚群膜表面部分造血细胞因子受体表达减低,CD34+细胞亚群转录因子GATA-1和GATA-2表达增高,这可能与MDS患者分化异常导致无效造血有关,且有望用于辅助诊断MDS。(4)MDS患者原代骨髓中CD34+CD38-CD123+细胞增高,并与恶性克隆负荷及骨髓造血.细胞分化异常项数目呈显著正相关,这些细胞表现为过度增殖、分化异常、部分造血因子受体的表达缺陷及凋亡逃逸等恶性特征,提示该团细胞可能是MDS恶性克隆细胞及最终转化为AML的恶性根源。
中文摘要第4-8页
Abstract第8-12页
缩略语/符号说明第15-17页
前言第17-21页
    研究现状、成果第17-20页
    研究目的、方法第20-21页
一、骨髓增生异常综合征骨髓造血细胞分化异常的研究第21-46页
    1.1 对象和方法第21-26页
        1.1.1 研究对象第21-22页
        1.1.2 主要试剂与仪器第22-24页
        1.1.3 研究方法第24-26页
        1.1.4 统计学分析第26页
    1.2 结果第26-38页
        1.2.1 临床参数第26-27页
        1.2.2 骨髓粒系细胞表面分化抗原表达情况第27-29页
        1.2.3 骨髓单核系细胞表面分化抗原表达情况第29-30页
        1.2.4 骨髓红系细胞表面分化抗原表达情况第30-32页
        1.2.5 抗原表达比例和模式的异常数目和IPSS、WPSS评分及恶性克隆负荷的关系第32-34页
        1.2.6 CD34~+细胞及CD34~+CD38~-细胞比例第34-37页
        1.2.7 骨髓单个核细胞细胞周期分布第37-38页
    1.3 讨论第38-45页
    1.4 小结第45-46页
二、骨髓增生异常综合征骨髓造血细胞分化异常相关机制研究第46-63页
    2.1 对象和方法第46-52页
        2.1.1 研究对象第46页
        2.1.2 主要试剂与仪器第46-48页
        2.1.3 研究方法第48-52页
        2.1.4 统计学分析第52页
    2.2 结果第52-58页
        2.2.1 骨髓CD34~+细胞亚群表面造血因子受体的表达第52-55页
        2.2.2 骨髓CD34~+细胞亚群核转录因子GATA-1和GATA-2的表达第55-57页
        2.2.3 GATA-1基因在MDS组和对照组的表达第57-58页
    2.3 讨论第58-62页
    2.4 小结第62-63页
三、骨髓增生异常综合征恶性克隆细胞数量及恶性特征的研究第63-76页
    3.1 对象和方法第63-67页
        3.1.1 研究对象第63页
        3.1.2 主要试剂与仪器第63-64页
        3.1.3 研究方法第64-67页
        3.1.4 统计学分析第67页
    3.2 结果第67-72页
        3.2.1 CD34~+CD38~-细胞中CD123的表达及其临床意义第67-68页
        3.2.2 MDS骨髓CD123~+CD34~+CD38~-及CD123~-CD34~+CD38~-细胞的GATA-1、GATA-2、CD71、EpoR、CDllb、CD114及Annexin Ⅴ表达情况第68-70页
        3.2.3 MDS患者CD34~+CD38~-CD132~+‘细胞比例与恶性克隆负荷及血细胞分化异 常项目数自勺相关性第70-72页
    3.3 讨论第72-75页
    3.4 小结第75-76页
全文结论第76-77页
论文创新点第77-78页
参考文献第78-87页
发表论文和参加科研情况说明第87-89页
附录第89-91页
综述 骨髓增生异常综合征造血细胞分化异常的研究进展第91-106页
    综述参考文献第100-106页
致谢第106-107页
附件第107-124页
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