石榴皮多糖的提取、纯化及免疫调节作用研究

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石榴为我国盛产的特色水果之一,每年都有大量的石榴皮被废弃,造成了资源的严重浪费。多糖是石榴皮的主要活性成分之一,但目前针对石榴皮的研究更多集中在石榴皮多酚的提取及其生物活性(主要是抗氧化活性及其抗肿瘤等),而关于石榴皮多糖的研究,国内外报道的文献尚且不多。因此,本文以石榴皮多糖为研究对象,对其进行提取工艺优化和分离纯化,并对石榴皮多糖和分离出的三种多糖组分进行结构的初步探究以及体外免疫调节活性的研究,最后由小鼠试验从体内证明石榴皮多糖能减轻小鼠机体受损害的程度,具有免疫调节功能。主要的结论如下:(1)果胶酶辅助提取石榴皮多糖,由单因素试验结果选出对多糖得率影响较大的三个单因素,进行响应面分析,得到最佳工艺参数为:酶解温度55 ℃,液料比20.5:1 mL/g,pH 7.5,加酶量0.68%,酶解时间19.7 min,石榴皮多糖的平均得率为27.3±0.08%,此方法操作简单,且多糖得率高。(2)对前面果胶酶法提取得到的石榴皮多糖粗品,进行脱色脱蛋白后得到精品石榴皮多糖(Pomegranate peel polysaccharide,PPP),通过 Cellulose DEAE-52 和Sephadex G-100柱层析法获得三个不同的组分,分别为PPP-1、PPP-2和PPP-3。苯酚-硫酸法测得总糖含量分别为75.62%、82%和90.02%,硫酸-咔唑显色法计算得到糖醛酸含量依次为6.33%、5.93%和9.53%。红外扫描光谱结果说明PPP、PPP-1、PPP-2和PPP-3中均含有β型吡喃糖环,证实是多糖物质。通过HPLC分析PPP、PPP-1、PPP-2和PPP-3的单糖组成及摩尔百分比,结果表明PPP、PPP-1、PPP-2和PPP-3主要单糖组成为葡萄糖醛酸、葡萄糖和木糖,均为酸性杂多糖,同时分析了 PPP、PPP-1、PPP-2和PPP-3的分子量,结果表明PPP的分子量有两个,分别是274.86 kDa、3.90 kDa。PPP-1、PPP-2和PPP-3的分子量分别为136 KDa,146KDa,184KDa。环境扫描电镜结果表明,PPP-1、PPP-2的外观是许多的小碎片,而PPP-3的外观结构是大的片状物质,三种组分的表面均光滑。(3)在一定的剂量范围(4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL 和 32μg/mL)内,PPP及不同纯化组分(PPP-1、PPP-2和PPP-3)分别作用于RAW264.7巨噬细胞,通过进行MTT试验、中性红吞噬试验、一氧化氮(NO)分泌量及其TNF-α、IL-2、IL-6和IFN-β含量的测定,来鉴定其体外免疫调节活性。结果表明,PPP及其组分刺激RAW264.7巨噬细胞后,均对细胞无毒性作用,并可增强其吞噬能力,NO分泌量及细胞因子含量均随多糖浓度增加而增大,由此可从体外细胞试验判断出PPP及其组分均具有免疫增强作用。(4)小鼠试验结果表明,PPP能提高免疫预防型小鼠的免疫调节能力,具体表现为:不同浓度PPP对小鼠进行免疫预防后,CTX造成小鼠的体重、脏器指数(脾脏、胸腺、肝脏、心脏、肾脏、睾丸、附睾和附睾脂肪)、血清中细胞因子(Ig-A、Ig-G、Ig-M、TNF-α、IL-2 和 INF-γ)的含量、肝脏抗氧化指标(CAT、GSH-PX、T-AOC、T-SOD 和 MDA)、全血指标(WBC、RBC、Hb 和 PLT)、脾淋巴细胞转化率、迟发型超敏反应的损害,在不同程度均有改善,且PPP浓度越高,改善的效果越明显,呈剂量效应关系。
摘要第3-5页
Abstract第5-6页
英文缩略词表第7-13页
第1章 绪论第13-21页
    1.1 前言第13页
    1.2 多糖的研究现状第13-19页
        1.2.1 多糖的提取第14页
        1.2.2 多糖杂质的去除第14-15页
        1.2.3 多糖分离纯化第15-16页
        1.2.4 多糖的生物活性第16-19页
    1.3 本课题研究的意义及内容第19-21页
        1.3.1 研究意义第19页
        1.3.2 研究内容第19-21页
第2章 石榴皮多糖粗品的提取工艺优化第21-33页
    2.1 引言第21页
    2.2 实验材料与仪器第21-22页
        2.2.1 实验材料第21页
        2.2.2 实验试剂第21页
        2.2.3 实验仪器第21-22页
    2.3 实验方法第22-23页
        2.3.1 PPP粗品的提取工艺第22页
        2.3.2 PPP粗品得率计算第22页
        2.3.3 单因素试验第22-23页
        2.3.4 响应面设计试验第23页
        2.3.5 结果分析第23页
    2.4 试验结果第23-31页
        2.4.1 单因素试验结果第23-26页
        2.4.2 响应面优化试验第26-31页
    2.5 本章小结第31-33页
第3章 石榴皮多糖分离纯化及其单糖组成第33-47页
    3.1 引言第33页
    3.2 试验材料与仪器第33-35页
        3.2.1 试验材料第33页
        3.2.2 试验试剂第33-34页
        3.2.3 试验仪器第34-35页
    3.3 试验方法第35-36页
        3.3.1 PPP粗品的分离纯化第35页
        3.3.2 UV分析第35页
        3.3.3 总糖和糖醛酸含量测定第35页
        3.3.4 单糖组成及其比例分析第35-36页
        3.3.5 分子量测定第36页
        3.3.6 红外光谱法第36页
        3.3.7 环境扫描电镜第36页
    3.4 结果与讨论第36-45页
        3.4.1 分离纯化试验结果第36-38页
        3.4.2 UV扫描结果分析第38-39页
        3.4.3 总糖和糖醛酸含量测定结果第39页
        3.4.4 单糖组成及其比例结果分析第39-41页
        3.4.5 分子量测定结果第41-42页
        3.4.6 红外光谱法第42-44页
        3.4.7 环境扫描电镜结果第44-45页
    3.5 本章小结第45-47页
第4章 石榴皮多糖及其组分对RAW264.7巨噬细胞免疫调节作用第47-59页
    4.1 引言第47页
    4.2 试验材料与仪器第47-49页
        4.2.1 试验材料第47页
        4.2.2 试验试剂第47-48页
        4.2.3 试验仪器第48-49页
    4.3 主要试剂配制方法第49页
        4.3.1 细胞培养基第49页
        4.3.2 MTT溶液第49页
        4.3.3 中性红溶液第49页
        4.3.4 多糖溶液第49页
    4.4 试验方法第49-52页
        4.4.1 RAW264.7巨噬细胞的培养第49-50页
        4.4.2 PPP及其组分对RAW264.7巨噬细胞存活率的影响第50页
        4.4.3 PPP及其组分对RAW264.7巨噬细胞吞噬活性的影响第50-51页
        4.4.4 PPP及其组分对RAW264.7巨噬细胞NO释放的影响第51页
        4.4.5 PPP及其组分对RAW264.7巨噬细胞细胞因子分泌的影响第51页
        4.4.6 PPP及其组分多糖内毒素(LPS)的检测第51页
        4.4.7 数据处理与统计分析第51-52页
    4.5 试验结果第52-56页
        4.5.1 PPP及其不同纯化组分内毒素(LPS)检测结果第52-53页
        4.5.2 PPP及其不同纯化组分对RAW264.7巨噬细胞存活率的影响第53页
        4.5.3 PPP及其不同纯化组分对RAW264.7巨噬细胞吞噬活性的影响第53-54页
        4.5.4 PPP及其不同纯化组分对RAW264.7巨噬细胞NO释放的影响第54-55页
        4.5.5 PPP及其不同纯化组分对RAW264.7巨噬细胞细胞因子分泌的影响第55-56页
    4.6 本章小结第56-59页
第5章 石榴皮多糖的体内免疫调节作用研究第59-75页
    5.1 引言第59页
    5.2 试验材料与仪器第59-60页
    5.3 试验方法第60-63页
        5.3.1 试验动物分组与给药第60-61页
        5.3.2 称量体重第61页
        5.3.3 免疫器官指数测定第61页
        5.3.4 小鼠脾淋巴细胞增殖率测定第61页
        5.3.5 小鼠全血四项指标测定第61-62页
        5.3.6 迟发型超敏反应测定第62页
        5.3.7 小鼠脾脏LDH和ACP测定第62页
        5.3.8 小鼠心脏、肾脏和肝脏指数测定第62页
        5.3.9 小鼠睾丸、附睾和附睾脂肪指数测定第62页
        5.3.10 小鼠血清指标测定第62页
        5.3.11 小鼠肝脏抗氧化指标测定第62-63页
        5.3.12 数据统计分析第63页
    5.4 结果与分析第63-70页
        5.4.1 PPP对小鼠体重的影响第63页
        5.4.2 PPP对小鼠免疫器官指数和脾淋巴细胞增殖率的影响第63-64页
        5.4.3 PPP对小鼠全血四项指标的影响第64-66页
        5.4.4 PPP对小鼠迟发型超敏反应的影响第66页
        5.4.5 PPP对小鼠脾脏LDH和ACP的影响第66-67页
        5.4.6 PPP对小鼠心脏、肾脏和肝脏指数的影响第67-68页
        5.4.7 PPP对小鼠睾丸、附睾和附睾脂肪指数的影响第68-69页
        5.4.8 PPP对小鼠血清指标的影响第69-70页
        5.4.9 PPP对小鼠肝脏抗氧化指标的影响第70页
    5.5 本章小结第70-75页
第6章 结论与展望第75-77页
    6.1 结论第75页
    6.2 展望第75-77页
参考文献第77-89页
致谢第89-91页
攻读学位期间的研究成果第91页
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