肿瘤是严重威胁人类健康的一类疾病,据世界卫生组织报告,全球新确诊和死于肿瘤的人数都在逐年增加,肿瘤的治疗已引起全世界的广泛关注。小干扰核糖核酸(Small interfering RNA,si RNA)是通过诱导核糖核酸干扰(RNA interference,RNAi)效应,在细胞质激发与之互补的目标信使核糖核酸(Messenger RNA,m RNA)沉默,进而调节蛋白的表达,为肿瘤治疗提供了一种有前景的手段。但是,si RNA本身易被核酸酶降解,所以稳定性较差;同时si RNA的亲水性强且带负电,所以不易透过带负电荷的细胞膜进入细胞质,最终导致难以发挥高效的RNAi作用;因此缺乏高效的si RNA以及能够有效结合、保护并递送si RNA载体的现状严重限制了其应用。本论文合成了一条经2′-甲氧基修饰的si RNA序列,对其RNA干扰效果进行评价;同时在穿膜肽八聚精氨酸的基础上合成了多种脂肪酸修饰的八聚精氨酸,经过一系列的试验筛选出能够高效结合、保护并递送si RNA的改性穿膜肽纳米粒;为了克服改性穿膜肽特异性差、靶向配体穿膜效率低的缺点,应用筛选出的改性穿膜肽和靶向配体制备多功能脂质体用于递送si RNA,并考察其体内外递送si RNA的效果。论文具体内容概括如下:1.si RNA在肿瘤细胞中RNAi效果评价设计了一条靶向survivin基因的2′-甲氧基修饰的si RNA序列,通过实时荧光定量PCR、Western blot、流式细胞术等方法检测了si RNA的活性,结果显示20 n M的si RNA作用72 h对survivin m RN A的表达抑制率达到了90%,对蛋白的表达抑制率也达到了80%以上;40 n M的si RNA能够有效地抑制肿瘤细胞的增殖,将细胞周期阻滞在G2/M期,使细胞凋亡率达到40%以上,而且能够导致多种细胞凋亡蛋白表达量和线粒体膜电位的变化。2.改性穿膜肽的合成、鉴定及细胞毒性评价通过固相肽合成的方法,分别将4种脂肪酸(辛酸、硬脂酸、油酸和亚油酸)共价结合到八聚精氨酸分子链游离氨基末端,制备两亲性的穿膜肽,并利用高效液相色谱法(HPLC)和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对其进行分离纯化和鉴定。通过MTT试验对改性穿膜肽进行细胞毒性评价,结果表明各组改性穿膜肽的细胞毒性相对较低,可以作为递送药物的载体材料。3.改性穿膜肽纳米粒的制备及递送si RNA的研究改性穿膜肽自身具备两亲性,能够形成自组装体系,同时带有正电荷,可以通过静电相互作用结合si RNA形成载si RNA的纳米粒,通过对其性质表征、细胞摄取效果和沉默靶基因能力等的研究,筛选出对si RNA结合效率高、保护能力强、递送效果好的改性穿膜肽纳米粒。各试验结果显示,OA-R8(油酸修饰的八聚精氨酸)纳米粒与si RNA的电荷比为1:1时,就可以结合全部的si RNA,具有最高的结合效率;在电荷比为4:1,具有良好的血清和聚阴离子稳定性;OA-R8载si RNA纳米粒的平均粒径为191.9±17.2 nm,Zeta电位为13.2±5.4 m V,粒径及电位分布均匀、稳定;体外细胞试验结果显示,通过网格蛋白和肌动蛋白介导的内吞作用,OA-R8载si RNA纳米粒能够成功地将si RNA转染进入到肿瘤细胞内,将Hep G2和A549细胞中survivin m RN A的表达量降低至30.2%和38.9%,survivin蛋白的表达量降低至42.7%和54.6%,说明改性穿膜肽OA-R8能够有效地穿过细胞膜,递送si RNA进入到肿瘤细胞质中,发挥高效的RNAi作用,进而抑制肿瘤细胞的增殖、阻滞细胞周期以及促进细胞凋亡等。4.基于改性穿膜肽的多功能脂质体的制备及体内外抗肿瘤研究虽然改性穿膜肽细胞毒性小、穿膜效果好,能高效地递送si RNA,但是改性穿膜肽缺少细胞特异性,不能很好地靶向到肿瘤组织,且带有大量正电荷,易被血液快速清除。因此本论文将转铁蛋白(Transferrin,Tf)作为靶向配体,改性穿膜肽OA-R8作为阳离子配体,共同修饰到脂质体表面制成Tf和OA-R8双修饰的多功能脂质体(TOLP),装载survivin si RNA后制成载si RNA的多功能脂质体(s TOLP)。s TOLP利用Tf高度的肿瘤细胞特异性和OA-R8较强的穿膜能力,可以靶向到肿瘤细胞,穿透细胞膜,可以将其用于体内外输送si RNA进行抗肿瘤的研究。s TOLP带有正电荷约3.4±2.3 m V,平均粒径在150.5±14.6 nm,粒度分布均匀,形状多为规则的球形。体外细胞试验结果表明,多功能脂质体对人正常细胞和肿瘤细胞的活力无影响,说明脂质体中引入改性穿膜肽OA-R8不会产生任何细胞毒性;引入OA-R8的载si RNA脂质体(s TOLP和OA-R8修饰的脂质体s OLP)与未经修饰的脂质体(s LP)和单独用Tf修饰的脂质体(s TLP)相比,细胞摄取效果更好,激光共聚焦观察细胞内化也得到了相同的结果;因此OA-R8的引入能够在体外提高脂质体向细胞内递送si RNA的能力,并且无任何毒副作用。体内的试验中,人肝癌异种移植裸小鼠经尾静脉注射脂质体,通过监测肿瘤体积、小鼠体重等变化,发现s TOLP组小鼠肝肿瘤的生长受到显著抑制,与生理盐水组相比肿瘤抑制率达到了61.7%;小动物活体成像及激光共聚焦观察si RNA在荷瘤小鼠体内的组织分布,发现经s TOLP和s TLP递送的si RNA主要蓄积在肝脏和肿瘤组织,s TOLP递送的到达肿瘤部位的si RNA比s TLP更多;经病理切片分析各组织器官的病理变化,发现s TOLP组小鼠的主要器官与对照组小鼠相比,没有明显的组织差异和病变,说明s TOLP在小鼠体内没有全身毒性,可用于体内递送si RNA进而抑制肿瘤的生长。综上所述,本论文合成的靶向survivin的si RNA序列能够在肿瘤细胞中发挥高效的RNAi作用,显著地抑制survivin基因的表达;合成的改性穿膜肽OA-R8具有低毒性,自组装形成的纳米粒对si RNA的结合效率高、保护能力强、递送效果好,提高了si RNA的稳定性和入胞效率;制备的OA-R8和Tf共同修饰的载si RNA多功能脂质体,克服了改性穿膜肽特异性差、转铁蛋白的穿膜效率低的缺点,可以跨越体内重重屏障将si RNA成功地递送到肿瘤组织,发挥高效的RNA干扰作用,最终达到抑制肿瘤生长的效果。
