花椒籽铁结合肽的提取、纯化及肽铁螯合物性质研究

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花椒籽仁中含有丰富的蛋白质,且氨基酸组成较合理,是一种优质的植物蛋白源。本文以韩城大红袍花椒籽为原料,经榨油后酶法进行水解,采用响应面法优化花椒籽蛋白水解物铁结合肽提取工艺、大孔吸附树脂分离纯化铁结合肽、研究铁结合肽的抗氧化和抑菌活性;采用正交法优化花椒籽蛋白肽铁螯合物的制备工艺,并对肽铁螯合物进行理化性质、氨基酸组成及其稳定性研究。本文研究对于新型补铁剂的开发、花椒产业副产物的资源利用、促进当地的经济发展及环境的保护都具有非常重要的现实意义。本论文主要研究结果如下:1.筛选出了制备花椒籽蛋白水解物铁结合肽的最适蛋白酶,利用响应面法优化确定酶水解花椒籽蛋白获得铁结合肽的最适工艺,结果表明,利用碱性蛋白酶在酶解温度65℃、酶解pH 10.47、酶解时间2.5 h、底物浓度27.70 mg/mL和酶与底物比0.09 mg/mL的条件下,酶解产生的水解液的水解度为7.23%,与铁的结合能力为585.66 mg-EDTA/g-protein。2.优化DA201-C型树脂对花椒籽蛋白铁结合肽分离纯化的工艺条件得出:样液多肽浓度0.25mg/mL,上样流速1.5mL/min,pH5的75%乙醇,以1.5mL/min流速进行洗脱,160 mL洗脱剂可基本上将花椒籽蛋白铁结合肽化合物完全洗脱下来,所得花椒籽蛋白多肽的纯度比纯化前样品的纯度提高了 15.29%。3.选用体外抗氧化方法研究了花椒籽蛋白铁结合肽的抗氧化活性得出:在较高浓度下,花椒籽蛋白铁结合肽具有较好的清除DPPH、羟基自由基能力,IC50值分别为0.61mg/mL和1.90mg/mL,且DPPH及羟基自由基清除能力与Vc相接近。花椒籽蛋白铁结合肽具有一定的铁还原能力,但Vc的还原能力远远高于花椒籽蛋白铁结合肽。此外,在一定的浓度范围内,该肽清除自由基能力及还原能力均具有明显的量效关系。通过对最低抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)的测定,确定花椒籽蛋白铁结合肽对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑菌活性,得出花椒籽蛋白铁结合肽对它们均有不同程度的抑制作用,其中对大肠杆菌以及枯草芽孢杆菌具有较强的抑制效果。4.通过正交分析法优化出花椒籽蛋白铁结合肽与氯化亚铁螯合制备肽铁螯合物的最佳工艺条件:在螯合时间45 min、螯合温度40 ℃、多肽溶液浓度为30 mg/mL、螯合pH 6、多肽和氯化亚铁的质量比(w/w)2.5:1的条件下,多肽与铁螯合率是96.84%。5.通过对肽铁螯合物进行硫化钠分析、光谱分析及电镜扫描得出:所得肽铁螯合物是经花椒籽蛋白多肽与氯化亚铁之间发生螯合反应所得到的一种不同于多肽的新物质,且该肽铁螯合物氨基酸总较齐全。红外扫描发现铁结合肽的-NH和COO—参与了螯合反应。稳定性试验表明:该肽铁螯合物的溶解度随着温度的提高而逐渐变大,且溶解度在酸性条件下比较好,pH 1时溶解度为3.44 g/100g;此外,肽铁螯合物的贮藏稳定性比硫酸亚铁和氯化亚铁高,氯化钠含量对花椒籽蛋白铁螯合肽的稳定性没有显著性的影响。
摘要第3-5页
Abstract第5-7页
第1章 绪论第11-19页
    1.1 花椒籽资源的开发利用现状第11-12页
        1.1.1 花椒籽第11页
        1.1.2 花椒籽蛋白资源开发利用第11-12页
    1.2 花椒籽蛋白肽的研究现状第12-13页
        1.2.1 抗氧化肽第12-13页
        1.2.2 降血压肽第13页
        1.2.3 抑菌肽第13页
    1.3 生物活性肽分离纯化方法第13-14页
        1.3.1 大孔吸附树脂第14页
        1.3.2 凝胶过滤色谱第14页
        1.3.3 反相高效液相色谱第14页
    1.4 矿物元素结合肽的研究现状第14-16页
        1.4.1 矿物元素结合肽第14-15页
        1.4.2 多肽与金属螯合机制第15页
        1.4.3 植物源铁螯合肽的研究第15-16页
    1.5 研究意义和内容第16-19页
第2章 酶法制备花椒籽蛋白铁结合肽的工艺优化第19-37页
    2.1 材料、试剂与设备第19-20页
        2.1.1 材料第19页
        2.1.2 试剂第19页
        2.1.3 仪器与设备第19-20页
    2.2 方法第20-23页
        2.2.1 花椒籽基本成分测定第20页
        2.2.2 蛋白酶活力测定第20页
        2.2.3 铁结合肽制备过程第20页
        2.2.4 水解酶的筛选第20-21页
        2.2.5 水解度测定第21页
        2.2.6 多肽含量测定第21页
        2.2.7 铁结合能力测定第21页
        2.2.8 花椒籽蛋白铁结合肽制备单因素试验第21-22页
        2.2.9 响应面优化第22页
        2.2.10 数据处理第22-23页
    2.3 结果与分析第23-35页
        2.3.1 花椒籽基本成分第23页
        2.3.2 蛋白酶活力的测定第23-24页
        2.3.3 花椒籽蛋白铁结合肽制备用酶的筛选第24-26页
        2.3.4 花椒籽蛋白水解及铁结合能力单因素试验第26-29页
        2.3.5 响应面优化花椒籽蛋白制备铁结合肽第29-35页
    2.4 讨论第35-36页
    2.5 本章小结第36-37页
第3章 花椒籽蛋白铁结合肽纯化及其生物活性研究第37-53页
    3.1 材料、试剂及设备第37-38页
        3.1.1 材料第37页
        3.1.2 试剂第37-38页
        3.1.3 仪器与设备第38页
    3.2 试验方法第38-42页
        3.2.1 大孔树脂的预处理第38页
        3.2.2 多肽含量的测定第38页
        3.2.3 大孔树脂的静态吸附与解吸试验第38-40页
        3.2.4 大孔树脂的动态吸附与解吸试验第40页
        3.2.5 抗氧化活性第40-41页
        3.2.6 抑菌活性第41-42页
        3.2.7 数据处理第42页
    3.3 结果与分析第42-50页
        3.3.1 大孔树脂的静态吸附与解吸试验第42-45页
        3.3.2 大孔树脂的动态吸附与解吸试验第45-47页
        3.3.3 抗氧化活性第47-49页
        3.3.4 抑菌活性第49-50页
    3.4 讨论第50-51页
    3.5 本章小结第51-53页
第4章 花椒籽蛋白肽铁螯合物的制备及其理化性质第53-73页
    4.1 材料、试剂及设备第53-54页
        4.1.1 材料第53页
        4.1.2 试剂第53页
        4.1.3 仪器与设备第53-54页
    4.2 试验方法第54-57页
        4.2.1 肽铁螯合物制备过程第54页
        4.2.2 肽铁螯合反应单因素试验第54-55页
        4.2.3 肽铁螯合条件正交试验第55页
        4.2.4 铁螯合率的测定第55-56页
        4.2.5 花椒籽蛋白肽铁螯合物成分分析第56页
        4.2.6 肽铁螯合物性质鉴定第56页
        4.2.7 氨基酸含量测定第56页
        4.2.8 溶解度测定第56-57页
        4.2.9 花椒籽蛋白肽铁螯合物的稳定性研究第57页
        4.2.10 亚铁含量测定第57页
        4.2.11 数据处理第57页
    4.3 结果与分析第57-71页
        4.3.1 铁标准曲线第58页
        4.3.2 肽铁螯合反应单因素试验结果第58-62页
        4.3.3 肽铁螯合条件正交试验结果第62-63页
        4.3.4 花椒籽蛋白肽铁螯合物鉴定第63-67页
        4.3.5 花椒籽蛋白肽铁螯合物氨基酸分析第67-68页
        4.3.6 花椒籽蛋白肽铁螯合物溶解度研究第68-69页
        4.3.7 肽铁螯合物稳定性研究第69-71页
    4.4 讨论第71-72页
    4.5 本章小结第72-73页
第5章 结论及展望第73-75页
    5.1 结论第73-74页
    5.2 展望第74-75页
参考文献第75-81页
致谢第81-83页
攻读学位期间研究成果第83页
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