1型糖尿病缺血/再灌注心肌易损性增加的新机制:脂联素抵抗及低脂联素血症

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背景近些年来糖尿病发病率迅速增加,糖尿病患者缺血性心脏病的发病率和死亡率均远高于正常人群,心血管疾病预后很差。其中,1型糖尿病又名胰岛素依赖型糖尿病,其原因是胰腺产生胰岛素的功能遭到破坏,导致胰岛素绝对缺乏,引起糖尿病。1型糖尿病约占糖尿病的10%,并每年以2-5%的速度增加。1型糖尿病是终身性疾病,好发于儿童和青少年,在美国18岁以下的青少年中,每300人中,就有一例1型糖尿病患者。研究发现1型糖尿病患者和动物其细胞因子和新陈代谢发生改变。脂联素(APN)是由脂肪细胞合成和分泌的细胞因子,血浆含量很高。脂联素不仅具有抗炎,调节糖脂代谢等功能,还具有抗凋亡作用。越来越多的动物实验表明,脂联素是潜在的心血管疾病治疗靶点,可通过激活其受体和下游AMPK信号以及抗氧化硝化等作用有效保护缺血/再灌注(I/R)心脏。研究发现脂联素发挥其作用主要通过膜受体AdipoR1和R2,调节下游AMPK和PPAR信号通路。肥胖相关疾病(如冠心病和2型糖尿病),其血浆脂联素水平下降,而与肥胖相关疾病不同,有报道发现1型糖尿病血浆脂联素水平升高,也有实验证实1型糖尿病血浆脂联素水平也是下降的。目前,关于1型糖尿病血浆脂联素的变化水平尚无定论。大量的临床试验表明,脂联素水平较高的人群,其心血管发病率较低,发展为糖尿病的几率也较低,血浆脂联素水平还可预测2型糖尿病发病的危险程度。此外,也有报道发现血浆脂联素浓度与胰岛素水平呈负相关。提高脂联素表达或给予外源性脂联素治疗可明显改善胰岛素抵抗,降低血糖。因此,脂联素可能是与胰岛素抵抗及糖尿病相关的关键因子之一,在糖尿病的治疗方面具有良好的应用前景。2004年的一项临床研究发现,血浆脂联素水平与心肌梗死发病率呈明显的负相关。血浆脂联素水平较高的男性,其心肌梗死的发病率极低。在动物模型上,脂联素基因敲除(ADN-/-)小鼠心肌缺血/再灌注损伤明显加重,而给予外源性脂联素治疗则可改善心肌损伤程度。另已证实2型糖尿病人血浆脂联素水平降低,其缺血性心脏病的发病率及心梗后死亡率明显增加。提示,血浆脂联素水平不仅与糖尿病的发生有关,血浆脂联素水平变化还可能是糖尿病患者缺血性心脏病发病率增加的关键因素之一。研究发现1型糖尿病病人比非糖尿病发生心血管事件的危险性高4.5倍,而脂联素水平较低时发生心血管疾病的危险增加,且糖尿病患者心肌易损性增加,故保护再灌注心肌对这些患者来说有重要意义。目前关于1型糖尿病血浆脂联素变化趋势尚不一致。鉴于脂联素具有保护心肌、内皮等作用,阐明脂联素与1型糖尿病心肌易损性增加的关系及机制无疑对防治糖尿病性缺血性心脏病有重要意义。在高脂血症和肥胖模型上,有研究发现血浆脂联素水平下降,其受体AdipoR1和R2表达也下降,从而降低了脂联素作用的敏感性,影响脂联素发挥其促进脂肪酸氧化、降低血糖、改善胰岛素抵抗等作用。例如,在高脂血症大鼠中发现,脂联素受体R1和R2表达明显下降,导致血管反应性对脂联素的反应下降,引起脂联素抵抗,然而,1型糖尿病模型是否存在脂联素抵抗目前尚不明确。因此,我们拟对如下问题进行研究:①1型糖尿病血浆APN水平及心肌组织其受体表达是否变化,其时相特点为何,是否存在脂联素抵抗或低脂联素血症;②如存在脂联素抵抗或低脂联素血症,其对1型糖尿病I/R心肌易损性的影响及机制如何。如阐明这些问题,可为深化认识糖尿病心肌易损性及其机制提供实验依据,并可能为防治糖尿病性I/R心肌损伤提供新策略和新靶点。目的(1)明确1型糖尿病小鼠不同糖尿病持续时间血浆脂联素和心肌组织AdipoR1和AdipoR2的表达变化。(2)探讨不同糖尿病持续时间小鼠MI/R后的心肌损伤程度的变化,明确外源性脂联素治疗是否具有心肌保护作用。(3)阐明氧化/硝化应激在脂联素保护1型糖尿病小鼠缺血/再灌注心肌中的作用。方法(1)小鼠缺血再灌注模型的建立:用6.0丝线在小鼠左前降支距根部2-3mm处打一活结,造成心肌缺血,30min后,将活结打开再灌注。再灌注3h心肌进行凋亡相关检测;再灌注24h心肌用于检测心梗范围。假手术组给予相同方法处理,不同的是小鼠左前降支不行结扎。(2)1型糖尿病模型的建立:20-25g Swiss小鼠,给予STZ(40mg/kg)腹腔注射,连续5天,剪尾检测血糖,约5天后血糖水平>10mmol/L为模型建立成功。(3)心肌凋亡检测:ELISA试剂盒检测心肌组织Caspase-3活性以及末端脱氧核苷基转移酶介导的dUTP原位平端标记法(TUNEL)原位检测细胞凋亡。(4)心肌梗死范围:伊文氏蓝/TTC双染色法。(5)血浆乳酸脱氢酶的测定:ELISA试剂盒检测血浆乳酸脱氢酶。(6)血浆脂联素浓度:ELISA试剂盒检测血浆脂联素浓度。(7)AdipoR1和AdipoR2表达检测:Western-blot检测心肌组织AdipoR1和AdipoR2表达,心肌组织用预冷至0°C的PBS(pH7.4)清洗后移入预冷的裂解液中并剪碎。组织匀浆后12,000×g4℃离心10min,取上清。BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。将蛋白样品行SDS-PGEA电泳,用半干电转法将蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上。5%的脱脂奶粉室温封闭1h。将PVDF膜和一抗一起孵育,4°C过夜;用TBST缓冲液漂洗,将膜与偶联二抗37°C一起孵育1h(二抗为辣根过氧化物酶标的山羊抗兔抗体),洗去所有未结合的二抗后,使用ECL-plus免疫检测试剂盒进行化学发光检测。(8)一氧化氮(NO)及其在体代谢产物(NO2和NO3),统称为NOx,采用硝酸还原酶法检测。(9) O2 ̄生成采用荧光素增强的化学发光法和原位二氢乙啶(DHE)染色法检测。(10)心肌ONOO-水平:采用ELISA试剂盒检测。结果(1)与正常小鼠相比,1型糖尿病小鼠血浆脂联素水平在发病1周增高(P <0.01),后随着病程延长,其水平下降,7周时出现低脂联素血症(P <0.05)。其受体AdipoR1在发病1、3周时下降(P <0.05),而后表达逐渐增高,7周时AdipoR1表达较正常对照组增高(P <0.05)。(2)与正常小鼠MI/R相比,1型糖尿病小鼠MIR后,心肌梗死面积及心肌细胞凋亡增加,表现为TUNEL阳性细胞比例和Caspase-3活性增加(P <0.05),并且随着糖尿病病程延长,其心肌损伤加重。(3)再灌注前给予1型糖尿病发病1周的小鼠腹腔注射脂联素球状片段治疗,心肌梗死面积及心肌细胞凋亡无明显变化,而给予AMPK激动剂(AICAR)可明显降低心肌梗死面积及心肌细胞的凋亡(P <0.05versus DM1+MI/R组)。(4)再灌注前给予1型糖尿病发病7周的小鼠腹腔注射脂联素球状片段和AICAR治疗,心肌梗死面积及心肌细胞凋亡明显减轻(P <0.05versus DM7+MI/R组)。(5)与正常对照组相比,1型糖尿病小鼠随着病程延长,NOX生成增加。MI/R使其表达进一步增加。(6)与正常对照组相比,1型糖尿病小鼠随着病程延长心肌O2 ̄生成增加,MI/R使其生成进一步增加。(7)1型糖尿病小鼠心肌ONOO-生成显著增加(P <0.05vs.WT+Sham组),MI/R使其生成进一步增加(P <0.05vs.DM+Sham组)。(8)1型糖尿病7周小鼠再灌注前10分钟给予gAD和EUK134(ONOO-清除剂,5mg/kg)治疗,可使心肌ONOO-生成降低,并可缩小MI/R后的心梗面积,抑制心肌细胞凋亡。结论(1)1型糖尿病小鼠血浆脂联素水平随着病程延长,呈早期增高,晚期下降的趋势。而受体AdipoR1表达则表现为早期表达降低,晚期升高。提示1型糖尿病小鼠早期可能存在脂联素抵抗,晚期可能存在低脂联素血症。(2)再灌注前补充外源性脂联素球状片段对1型糖尿病小鼠早期MI/R心肌损伤无保护作用,而AICAR可减轻MI/R后心肌损伤,提示早期AdipoR1的降低可能是脂联素干预无保护作用的原因。(3)再灌注前补充外源性gAD可减轻1型糖尿病小鼠晚期MI/R的心肌损伤,提示低脂联素血症可能是晚期1型糖尿病小鼠MI/R后心肌损伤加重的原因。(4)1型糖尿病小鼠随着病程延长,其氧化/硝化损伤加重,MI/R后其氧化/硝化损伤进一步加重,而gAD和EUK134可改善氧化/硝化程度并可减轻MI/R后心肌损伤。提示氧化/硝化应激是脂联素保护1型糖尿病小鼠缺血/再灌注心肌损伤的关键因素。
缩略语表第5-7页
中文摘要第7-13页
Abstract第13-19页
前言第20-22页
文献回顾第22-44页
实验一 1 型糖尿病病程对小鼠缺血/再灌注损伤的影响第44-55页
    1 材料第44-45页
    2 方法第45-50页
    3 结果第50-53页
    4 讨论第53-55页
实验二 1 型糖尿病小鼠早中晚期血浆脂联素水平及心脏中其受体的变化第55-71页
    1 材料第55-56页
    2 方法第56-59页
    3 结果第59-69页
    4 讨论第69-71页
实验三 氧化/硝化应激在脂联素保护 1 型糖尿病小鼠缺血/再灌注心肌中的作用第71-80页
    1. 材料第71页
    2. 方法第71-74页
    3. 结果第74-78页
    4. 讨论第78-80页
小结第80-81页
参考文献第81-102页
个人简历和研究成果第102-103页
致谢第103页
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论文编号ABS4029009,这篇论文共103页
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