背景与目的后发性白内障(又称后囊膜浑浊,posterior capsular opacification, PCO)是目前白内障术后最主要的并发症,其主要的病理机制是术后残留的晶状体上皮在活化或升高的细胞因子等作用下发生细胞增殖、迁移和上皮向间充质转分化等。研究发现肿瘤坏死因子-α (TNF-α)是白内障术后房水中存在的一种重要的炎症因子,被认为和PCO的形成有关。另外有研究表明环氧合酶-2(Cyclooxygenase-2, COX-2)抑制剂在体内实验和体外模拟实验中均可以有效地抑制PCO的发生,但其药理作用的分子机制仍不明确。因此本学位论文旨在通过体外培养的人晶状体上皮细胞模型,探究TNF-α对COX-2的表达调控机制,及COX-2在TNF-α诱导的人晶状体上皮细胞增殖和转分化中的作用及其可能的机制。方法体外培养的人晶状体上皮细胞(hLEC-B3)分为两组,即10 ng/ml TNF-α刺激组和无TNF-α刺激的对照组,在刺激后6 h、24 h、48 h,用实时定量PCR和Western Blot检测COX-2 mRNA和蛋白的表达水平。同时,经TNF-a刺激后24 h,用定量PCR和Western Blot检测细胞增殖和EMT的标志物细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)和波形蛋白(Vimentin) mRNA及蛋白表达水平,并用Cell Count Kit-8(CCK-8)试剂盒和Transwell迁移小室实验分别检测细胞增殖和迁移能力。在光学显微镜观察细胞形态变化。在TNF-α刺激前加入溴芬酸钠24 h以阻断COX-2,然后检测细胞增殖和EMT的改变。观察hLEC-B3细胞经10 ng/ml TNF-α刺激时间梯度效应,用Western Blot检测JNK磷酸化水平的改变以及转录因子c-Jun的活化水平,提取细胞核蛋白的检测和细胞免疫荧光的方法来观察p-c-Jun的入核情况。预先加入JNK抑制剂SP600125或转染c-Jun siRNA后检测COX-2表达的改变,以鉴定JNK信号通路对COX-2表达的调控作用,并利用染色质免疫共沉淀(ChIP)验证p-c-Jun与COX-2启动子区DNA序列的直接相互作用。为进一步探索COX-2可能介导的机制,通过Western Blot及双荧光素酶报告基因系统的方法来研究TNF-α对GSK-3β/β-catenin通路以及β/-catenin转录活性的影响,并通过阻断COX-2或JNK通路以探究JNK/COX-2在GSK-3β/β-catenin通路活化中的作用。结果TNF-α可以诱导hLEC-B3细胞COX-2的高表达以及Cyclin D1和Vimentin表达的升高,并促进细胞增殖、迁移和纤维化形态改变。预先加入澳芬酸钠阻断COX-2可以抑制TNF-α诱导的Cyclin D1和Vimentin的高表达及细胞增殖和EMT。TNF-α通过激活JNK/p-c-Jun信号通路调控COX-2的表达,ChIP-qPCR结果显示p-c-Jun与COX-2启动子区DNA序列具有直接相互作用。另外,TNF-α可以激活GSK-3β/β-catenin通路并提高β-catenin转录活性。药物阻断COX-2或JNK信号通路均可以抑制TNF-a活化的GSK-3β/β-catenin通路和β-catenin转录活性。转染β-catenin siRNA可减弱了溴芬酸钠对TNF-α诱导的Cyclin D1和Vimentin高表达的抑制效应。结论TNF-α通过JNK信号转导通路调控COX-2的表达。JNK/COX-2可能通过介导GSK-3β/β-catenin通路,在TNF-α诱导的hLEC-B3细胞增殖和EMT中发挥了重要作用。
