动物机体长时间暴露于热环境中而缺乏适当的降温措施时可能会招致组织器官的损伤,甚至危及生命。而危及生命的病因通常与心脏的疾患存在明显的关联性,常可导致心脏骤停、中风等。然而,生物体内也存在能够承受恶劣环境和刺激而产生的一类起保护作用的热休克蛋白(Heat Shock Proteins,HSPs),这种HSPs常常受到热休克转录因子-1(Heat Shock Transcription Factor-1,HSF-1)的调控,以保持生物体内Hsps的动态平衡。Hsps的过表达对受应激原刺激的动物机体或细胞有保护作用,但Hsps过表达的程度以及如何能诱导Hsps过表达以应用于生产实践等问题仍不十分清楚。况且,由于研究对象体内复杂的生物调节活动以及活体研究过程中众多环境因素的影响,使得研究结果难以真实反映Hsps改变与应激损伤之间的对应关系,从而出现认识上的偏差。所以,在活体和离体培养细胞上同时进行Hsps随应激时间而呈现的变化规律研究,如hsps mRNA转录状态、Hsps表达的动态变化规律与应激损伤及其程度,对应激性病理损伤、应激性疾病发生机理的阐明和动物抗应激危害措施的提出等具有重要意义。为此,本文通过体内、外对比的方式,首先建立了不同热应激时间的体内、外大鼠心肌细胞模型,检测不同时间热应激处理后,体内、外大鼠心肌细胞的应激性病理损伤情况,同时观察热休克蛋白Hsp27和αB-Crystallin及其相应mRNA在心肌细胞中的定位和表达情况,探讨小分子热休克蛋白在大鼠心肌细胞中的作用。在此基础上,进一步研究动态观察Hsp27和αB-Crystallin在48 h热应激过程中的动态表达变化以及与热休克转录因子Hsf-1之间的相互关系。将适应性饲养5d后的60日龄SD大鼠(n=60)随机分为6组,分别为对照组(0 min)和热应激组(20 min,40 min,60 min,80 min,100min热应激组),每组10只。除了对照组外,将其余各组大鼠立即置于预热至42℃、相对湿度为55%～65%的人工气候室内。待到限定的热应激时间点时,迅速断颈处死大鼠,采取血液,分别检测血清内心肌损伤相关酶谷草转氨酶(AST)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)含量,同时采取大鼠的心脏,一部分置于4%多聚甲醛溶液中固定,用于组织病理学和免疫组织化学检测,另一部分迅速置于液氮中保存,用于Western blot和荧光定量Real Time PCR检测。试验结果显示,热应激大鼠在42℃环境下暴露20 min后,即出现出汗、饮水增加。热应激至60 min后,死亡率达5%。应激时间延长至80 min时,死亡率为50%。而热应激至120 min后,大鼠死亡率达到100%;病理组织学结果发现,随着热应激时间的延长,大鼠心肌细胞的应激性病理损伤程度逐渐加重,呈现由急性变性到细胞坏死的现象;Western Blot半定量检测结果显示,从热应激的20 min开始,αB-Crystallin蛋白的表达量呈现先下降、然后升高、再于热应激至60 min～100 min时下降为特征的波动;免疫组织化学结果发现,αB-Crystallin在各个热应激组以及对照组心肌细胞中均定位在细胞浆内,但从20 min热应激开始,αB-Crystallin在心肌细胞细胞浆中的密度減少,40 min热应激时有所增加,而从60min～100min的热应激期间,αB-Crystallin在心肌细胞细胞浆中的密度又明显减少,显示出与该蛋白定位相一致的结果。αB-Crystallin表达量高的热应激组大鼠心肌细胞的病理损伤较轻,而αB-Crystallin表达量少的热应激组大鼠心肌细胞则显示出较为严重的病理损伤,说明αB-Crystallin表达量的多少与热应激心肌细胞的应激性病理损伤的严重程度有相关性;Hsp27在大鼠心肌细胞中与αB-Crystallin的蛋白表达以及相应的mRNA的转录水平表现出一致的趋势,结果提示Hsp27和αB-Crystallin在热应激大鼠心肌细胞中可能发挥保护性作用。选取大鼠心肌母细胞系H9C2在含5%CO2培养箱内于37℃下进行传代培养,以1.0×106接种于细胞瓶中,待细胞融合率达到90%以上时,将心肌细胞分成6组,分别为对照组(0 min)和热应激组(20 min,40 min,60 min,80 min,100 min热应激组)。除对照组外,将其余各组心肌细胞迅速置于预热至42℃的含5%的CO2培养箱中,待热应激结束后,将其中一组心肌细胞以4%多聚甲醛固定,用于细胞病理学及免疫细胞荧:光检测;另外一组则于液氮中保存,用于Western Blot和Real Time PCR检测。试验结果显示,20 min的热应激处理后,心肌细胞发生以细胞体积肿大为特征的急性变性,热应激40min后,心肌细胞呈现颗粒变性并出现细胞核固缩。80min～100 min热应激后,心肌细胞呈现颗粒变性和细胞肿胀为特征的病理变化。Western Blot半定量检测结果显示,热应激40 min～60 min,αB-Crystallin蛋白表达量显著低于对照组,热应激80 min～100 min时,αB-Crystallin蛋白表达含量出现升高。免疫荧光结果中αB-Crystallin的信号强弱也同样证实了蛋白表达量改变的结果。不过,热应激80 min后,αB-Crystallin阳性信号不仅定位于心肌细胞浆中,也同样可见于细胞核内,这与在体大鼠心肌细胞中蛋白的分布和表达趋势略有不同,而且体内、外心肌细胞的热应激病理损伤程度也不一致,离体心肌细胞中所呈现的应激性病理损伤较轻微,可能与小热休克蛋白的定位有关。而在H9C2细胞中,Hsp27的蛋白表达量水平和其相应的mRNA水平在热应激处理后也基本呈现出与αB-Crystallin相一致的变化。尽管在体外培养细胞与生物整体心肌细胞中Hsp27和αB-Crystallin的表达趋势各有不同,但总体变化趋势是一致的,即Hsp27和αB-Crystallin不论从蛋白水平或mRNA水平上在体内、外大鼠心肌细胞中都保持基本一致的表达趋势。在此基础上进一步利用蛋白相关性分析软件STRING(Version 9.1)分析鼠原Hsp27和αB-Crystallin之间的关系,发现其两者拥有很高的共表达系数。通过体内外对比的方法,初步发现体内、外大鼠心肌细胞中Hsp27和αB-Crystallin在mRNA基因水平和蛋白水平上都可以被急性热应激所诱导,且Hsp27和αB-Crystallin可能通过共表达的方式在大鼠心肌细胞中发挥其分子伴侣作用。本试验在成功建立原代培养大鼠心肌细胞的热应激模型基础上,进一步研究了HSPs在热应激大鼠心肌细胞中的作用以及与HSF-1的相关性。将原代培养的大鼠心肌细胞在含5%CO2培养箱内于37℃培养48 h,待细胞融合率达到90%以上时,将心肌细胞分为热应激0min,10 min,20 min,40 min,60 min,120 min,240 min,360min和480 min组。待到限定的热应激时间点时,收集各组心肌细胞培养上清液,用于心肌细胞损伤相关酶ALT、LDH、CK、CK-MB的含量检测;同时收集各组热应激心肌细胞,分别用于免疫细胞荧光、Western Blot、荧光定量RT-PCR检测。试验结果显示,αB-Crystallin mRNA及hsp27 mRNA在热应激480min期间有显著改变,二者的mRNA转录水平从热应激20 min起就开始出现极显著地升高;Hsf-1在热应激至120 min后出现极显著升高;Hsp90的表达呈现出与Hsf-1表达相一致的趋势,而Hsp70则呈现与Hsf-1相反的表达趋势。利用STRING(version 9.1)蛋白分析软件分析各种Hsps之间的相关性发现,Hsf-1与Hsp90和Hsp70之间存在较强的相关性,说明Hsf-1可能不参与调控小热休克蛋白αB-Crystallin的表达。
