高分子键合紫杉醇胶束对鼠U14宫颈癌作用的实验研究

宫颈癌是中国女性生殖系统发病率最高的恶性肿瘤~[1]。在全球每年466000例新发病例中，80%病例发生在发展中国家，我国就占到全部新发病例的28.8%，达到13.15万。近年来随着在一些地区人乳头瘤病毒(humanpapilloma virus,HPV)感染率的上升和社会生活的变化~[4]，宫颈癌的发病居我国妇科恶性肿瘤之首，而且年轻宫颈癌患者数量有逐年增多的趋势~[5]。在上世纪80年代之前手术和放疗是宫颈癌的主要治疗方法，宫颈癌属于对化学药物治疗相对抗拒的肿瘤~[6]。由于年轻宫颈癌及患者局部晚期宫颈癌(Locally advanced cervical cancer，LACC)~[8]患者数量的增多，放射治疗引起年轻患者卵巢及生殖道的不可逆损伤逐渐显现出来，防碍了年轻宫颈癌治疗的进展。1983年，宫颈癌被证实是化疗敏感性肿瘤~[9]，并针对LACC提出新辅助化疗(neoadjuvant chemotherapy, NACT)的概念：宫颈癌手术前或放疗前加用2～3个疗程的化疗。经NACT使瘤体缩小和范围缩小，使临床分期转逆，使不能、不适手术者成为可行经腹广泛性全子宫切除术，消除亚临床转移，降低盆腔淋巴结转移率或盆腔、远处转移率，避免和减少大剂量放疗对卵巢及生殖道的不可逆损伤。化疗在宫颈癌的治疗中的作用逐渐被人们重视，特别近10年来对宫颈癌的综合治疗日益受到关注，已成为现代处理宫颈癌的一个重要策略。但是化学药物在杀灭肿瘤细胞的同时，严重副作用也随之而来，给患者带来了治疗痛苦。如何减轻或消灭化学药物的副作用，提高药物的亲肿瘤组织特异性成为肿瘤治疗不可逾越的障碍。肿瘤靶向治疗是利用具有一定特异性的载体，将药物或其他杀伤肿瘤细胞的活性物质定向作用于肿瘤组织，而不影响正常组织细胞的功能，从而提高疗效、减少毒副作用的一种方法。恶性肿瘤的靶向治疗已经成为国内外学者的研究重点及热点。靶向治疗分为主动靶向和被动靶向，叶酸受体属于主动靶向给药载体的配体系统。鉴于叶酸受体在正常组织中的表达高度保守,而在大部分恶性肿瘤组织中的高度表达，利用叶酸受体进行肿瘤特异性治疗受到人们的关注。紫杉醇治疗多种肿瘤有效，并被用作一线广谱抗癌药物，然而，由于紫杉醇资源匮乏，水溶性低、毒副作用高等缺点，极大的限制了其在临床上的应用。人们试图通过改变紫杉醇的药物剂型，来降低其毒副作用，并提高其在靶部位的药物浓度，以期更好地发挥疗效。根据肿瘤治疗的靶向理论，本研究选用两亲性生物降解高分子聚乙二醇与带侧羧基的聚（乳酸-碳酸酯）嵌段共聚物MPEG-b-P（LA-co-MCC）同紫杉醇键合，制成高分子的前体药物，并将其与携带叶酸配体的聚合物MPEG-b-P（LA-co-DHP/FA）组装成纳米胶束。增加紫杉醇在水中的溶解度，延长药物在体内的循环时间，提高生物利用度，降低毒副作用，并可能对过表达叶酸受体的肿瘤细胞具有主动靶向性，从而提高疗效。为探讨其对肿瘤的抑制作用，采用鼠U14宫颈癌细胞株进行体外、体内药效实验，并进行相关检测以期为临床应用提供理论依据。目的：通过鼠U14宫颈癌细胞株进行体外、体内药效实验，探讨高分子键合药物的肿瘤抑制作用。方法：体外实验应用MTT法检测不同药物对U14宫颈癌细胞的增殖抑制作用，Annexin V-PI双染法检测细胞凋亡；体内实验建立鼠U14宫颈癌模型，分别以FA-PTX胶束、PTX胶束、PTX对其进行治疗，并计算瘤重抑制率；流式细胞仪及TUNEL法检测细胞凋亡率；病理学HE染色观察用药后肿瘤组织形态及变化；免疫组化方法检测Caspase-3及Bcl-2的表达；用药后观察荷瘤鼠生存状态及生存时间。结果：1、纳米胶束载体呈球形，粒径分布均匀，分散性好，直径80nm，分散系数为0.2。紫杉醇被保护在胶束的亲脂性内核中，含量22.5%，胶束外层由亲水性的PEG构成，对胶束有稳定化作用，对药物有增溶作用，并且保护胶束免遭人体内免疫系统的攻击。临界胶束浓度较小，所得载药纳米胶束的载药率较高且稳定。2、体外实验：⑴M TT法测定不同药物对U14宫颈癌细胞的增殖抑制作用，紫杉醇、紫杉醇胶束、叶酸紫杉醇胶束对U14宫颈癌细胞株的抑制率具有浓度和时间依赖性。⑵A nnexin V-PI双染法检测细胞凋亡提示，高分子键合紫杉醇胶束同紫杉醇一样可以诱导肿瘤细胞凋亡，且其通过凋亡作用来抑制肿瘤细胞的生长，三种药物作用细胞后，细胞的凋亡率由高到低依次为叶酸紫杉醇胶束＞紫杉醇胶束＞紫杉醇。⑶不同药物作用U14宫颈癌细胞，从形态学上可以直观的观察到，高分子键合紫杉醇胶束对肿瘤细胞有明显的抑制作用，且其细胞抑制作用可以等同紫杉醇纯药，紫杉醇纯药对细胞的毒害、杀伤作用更明显。3、体内实验：⑴三种药物中，叶酸紫杉醇胶束的抑瘤效果最好，瘤重抑制率：叶酸紫杉醇胶束＞紫杉醇胶束＞紫杉醇。⑵流式细胞仪及TUNEL法检测细胞凋亡显示，三种药物均能诱导肿瘤细胞凋亡，其抑瘤作用是通过诱导细胞凋亡实现的，三者凋亡率：叶酸紫杉醇胶束＞紫杉醇胶束＞紫杉醇。⑶病理HE染色表明，载药纳米微粒能通过叶酸介导的主动靶向作用到达肿瘤组织起到抑制作用，并在肿瘤组织局部引起炎症反应。⑷免疫组织化学检测到的Caspase-3、Bcl-2的表达情况知，其药物的肿瘤细胞凋亡机制同调控抑癌基因、癌基因的水平有关。⑸生存实验表明，高分子键合药物能减少药物的副反应，延长生存时间。结论：1.成功制作了免受人体免疫系统攻击的球形纳米胶束载体，紫杉醇被保护在胶束的亲脂性核中，具有增溶、载药率高、稳定化作用。2.紫杉醇、紫杉醇胶束、叶酸紫杉醇胶束对肿瘤细胞均有抑制作用，具有时间及剂量的依赖性，实验证明纳米胶束载体未改变紫杉醇抗肿瘤作用，紫杉醇的细胞毒作用最明显。3.高分子键合叶酸紫杉醇胶束优于紫杉醇纯药，对U14宫颈癌小鼠的治疗效果最明显，荷瘤小鼠生存时间显著延长，毒副作用显著降低，显示了靶向药物生物利用度高，具有水溶性、可控释性的主动靶向优势。4.高分子键合紫杉醇胶束通过诱导细胞凋亡来抑制肿瘤的生长，诱导肿瘤细胞凋亡机制同调控抑癌基因、癌基因的表达水平相关。