含Y[F]XNXXF[Y]基序的Numb相互作用蛋白筛选及Numb调节EAAT3内吞的机制

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Numb最初是作为果蝇早期胚胎发育的细胞命运决定因子被发现的,后续研究表明它在膜蛋白内吞、细胞粘附、迁移和泛素化降解等生物学过程中都发挥了重要作用。实验室的前期研究发现,Numb可以与NPC1L1C端一个保守的YVNHSF基序(motif)相互作用并介导NPC1L1内吞,且将YVNHSF中的Y替换成F并不影响相互作用。Y[F]XNXXF[Y](X代表任何氨基酸)类似传统的Numb结合基序NPXY但又有不同,是一种新的介导内吞的Numb结合基序。为了确认其他蛋白是否含有Y[F]XNXXF[Y]这一新的Numb结合序列,我们用Y[F]XNXXF[Y]对蛋白质数据库进行搜索,得到了上千个人源蛋白质。进一步,把这些候选蛋白的Y[F]XNXXF[Y]位置限制在靠近C端,并把功能限定在与Numb已知功能相关且生物学功能相对明确的范围内,得到EAAT3、PXN、RAPGEF5、PRKCA和PIP5K1B5个蛋白质,其中只有对EAAT3的YVNGGF序列突变引起EAAT3细胞定位的变化。EAAT3是一种高亲和性、钠离子依赖型的谷氨酸转运体,在细胞膜上发挥作用,但主要分布在细胞质内。尽管有研究发现它能快速地在细胞膜和细胞质之间转运,其分子机制并不十分清楚。本论文研究发现,EAAT3通过其C端的YVNGGF基序与Numb发生相互作用,并且这一相互作用决定了EAAT3在细胞内的分布。突变EAAT3 YVNGGF基序中的Y503、N505和F508,或是在细胞中干扰Numb,均导致EAAT3内吞受阻,在细胞内分布异常。因此,我们认为Numb是通过结合EAAT3 YVNGGF基序介导了EAAT3的内吞,从而决定其亚细胞定位。综上,本学位论文从生物信息学方法寻找Numb相互作用蛋白质出发,找到了和Numb相互作用的EAAT3蛋白,进而探索了Numb影响EAAT3细胞定位的机制,初步阐明EAAT3在细胞膜和细胞质之间转运的可能机制。我们认为,这种模式为寻找更多的Numb相互作用蛋白质提供了便捷和有效的途径。
致谢第5-7页
摘要第7-9页
Abstract第9-10页
缩略语表第11-12页
1 引言第12-14页
2 研究思路第14-15页
3 实验材料与方法第15-30页
    3.1 实验材料第15-16页
    3.2 实验方法第16-30页
4.实验结果第30-55页
    4.1 含Y[F]XNXXF[Y]基序蛋白质的生物信息学筛选及验证第30-43页
    4.2 Numb通过YVNGGF基序和EAAT3相互作用并介导EAAT3内吞第43-55页
5.讨论第55-57页
6.结论第57-58页
7.参考文献第58-62页
8.本学位论文创新点第62-63页
综述第63-74页
    参考文献第69-74页
附件第74-90页
作者简历及科研成果第90-91页
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论文编号ABS3127008,这篇论文共91页
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