目的胶质瘤是人类脑肿瘤中最常见、最具侵袭性的类型之一,探索发现新的胶质瘤相关基因具有重要意义。本研究旨在从组织学水平研究Gpx4在胶质瘤患者中的表达,同时分析Gpx4与胶质瘤患者临床病理特征以及增殖标志物Ki-67的表达相关性,探讨Gpx4在胶质瘤的发生发展过程中发挥怎么的作用;另外,从细胞学水平研究Gpx4对胶质瘤细胞的增殖、迁移以及凋亡的影响,并且探索Gpx4调控胶质瘤细胞生长的可能机制。方法1.使用免疫印迹(Western blot,WB)检测Gpx4在正常脑组织以及不同的胶质瘤组织中的表达。利用免疫组化(IHC)研究Gpx4与Ki-67在81例胶质瘤组织石蜡切片中的表达情况,使用卡方检验分析Gpx4的表达与胶质瘤患者临床病理特征及Ki-67表达之间的关系,利用Kaplan–Meier生存曲线分析Gpx4的表达高低对胶质瘤患者的预后产生的影响。2.在不同的胶质瘤细胞株(A172、H4、U87、U251以及U118)利用WB的方法检测Gpx4的表达情况,并且筛选出高表达Gpx4的细胞株。选取U87胶质瘤细胞株,瞬时转染Gpx4的小干扰质粒,筛选出干扰效率最高质粒。3.将Gpx4的小干扰RNA(Gpx4-siRNA#1)转染至U87细胞中,通过WB实验检测敲低Gpx4的表达对细胞增殖的指标PCNA以及cyclinD1表达的影响,利用流式细胞术分析敲低Gpx4之后对U87细胞周期的影响,利用CCK-8试验分析干扰Gpx4的表达之后对细胞增殖能力的影响,以及进行克隆形成实验分析敲低Gpx4的表达对细胞增殖的影响。4.利用划痕试验和transwell试验研究Gpx4对U87细胞迁移能力的影响,同时用WB分析迁移相关蛋白的表达情况。5.使用流式细胞技术检测对照组与小干扰组细胞的凋亡程度,分析干扰Gpx4对U87细胞凋亡过程的影响,同时利用WB检测与凋亡相关的蛋白的表达情况,便于进一步研究可能的分子机制。结果1.Western blot检测结果表明,Gpx4在胶质瘤组织中的表达明显高于正常脑组织,并且随着胶质瘤WHO分级的增加Gpx4的表达也逐渐增强。免疫组织结果表明Gpx4的表达强弱与Ki-67以及WHO分级具有明显的统计学相关性,而与其他的病理学特征没有明显的相关性。不同级别的胶质瘤组织中,Gpx4的蛋白质表达水平存在差异。Kaplan–Meier生存曲线分析表明,Gpx4的表达越高的患者总生存率明显低于Gpx4表达低的患者(P<0.05)。2.在A172、H4、U87、U251以及U118胶质瘤细胞中通过WB检测发现,Gpx4在U87细胞中表达最高。将Gpx4的小干扰质粒转染至U87细胞中之后,检测发现Gpx4-siRNA#1的干扰效率最高。3.通过WB检测发现,敲低Gpx4的表达之后,细胞增殖的指标PCNA以及cyclinD1表达都降低了,流式细胞术分析表明敲低Gpx4的表达能够增加G1期的细胞,同时S期的细胞数量减少。CCK8试验和克隆形成试验表明干扰Gpx4的表达可以阻碍胶质瘤细胞的增殖。4.划痕试验和transwell试验结果表明敲低Gpx4的表达能够抑制细胞生长,同时WB结果表明抑制Gpx4的表达之后会促进E-cadherin的表达,同时Vimentin的表达也被抑制。5.流式检测结果表明干扰Gpx4表达之后,凋亡的胶质瘤细胞数量增加,WB结果表明敲低Gpx4能够促进cleaved caspase 3的表达,伴随着Bcl-2表达下降。结论1.Gpx4在胶质瘤组织中高表达,并且与增殖标志物Ki-67以及胶质瘤WHO分级具有明显的统计学相关性;Gpx4的表达高低与患者的预后情况密切相关,高表达Gpx4的胶质瘤患者预后较差。2.Gpx4能够调节胶质瘤细胞增殖、迁移、凋亡过程,敲低Gpx4的表达会导致细胞周期阻滞、降低细胞的迁移能力、促进细胞的凋亡。
