A20在肝癌细胞对TRAIL耐受中的作用研究

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肝细胞癌是世界上最常见的致死性恶性肿瘤之一,我国原发性肝细胞癌年发病率居全球之首,其手术切除率低,术后复发率高及死亡率高,对放化疗不敏感,临床缺乏有效的治疗手段,严重威胁着人民的健康。TRAIL是近年来发现的TNF超家族的又一成员,能够通过死亡受体活化途径诱导大多数肿瘤细胞如乳腺癌细胞,膀胱癌细胞,神经胶质瘤细胞等发生凋亡。肝癌即使得到根治性切除后,微量残留的肿瘤细胞仍能逃避免疫监视和免疫杀伤,并迅速复发,其重要原因就是肝癌细胞对以TRAIL为代表的经由死亡受体传导通路诱导的凋亡作用产生抵抗,其耐药机制尚不明确。A20最早在TNF、IL-1或LPS刺激后的人脐静脉内皮细胞中被发现。越来越多的证据支持,A20依赖对靶蛋白的泛素化修饰来调节细胞免疫和炎症反应。A20作为联系基因多态性与多种自身免疫性疾病(包括克罗恩病,系统性红斑狼疮,类风湿关节炎,1型糖尿病)的关键蛋白,也折射出其调节免疫稳态的重要性。A20还可以负性调控NF-κB信号通路来行使其抗炎作用。此外,越来越多的研究表明,A20在一些淋巴瘤中扮演着抑癌基因的角色。然而,A20也可以降低TNF介导的细胞凋亡和坏死,并且在肉瘤中A20的过表达甚至可能介导了TRAIL的耐受,但其具体作用尚不清楚。在本研究中,我们发现,A20在肝癌组织和肝癌细胞系中都存在高表达,并参与了肝癌细胞对TRAIL的抵抗,联合应用TRAIL及A20基因沉默技术可抑制肝癌细胞生长并诱导TRAIL耐受肝癌细胞凋亡,从而为联合应用TRAIL和A20基因沉默技术或A20靶向抑制剂提供了实验依据。本研究主要应用细胞培养、酸性磷酸酶法、siRNA技术、流式细胞术、shRNA技术、Western blotting等,研究了人肝细胞癌组织和肝癌细胞系中的A20的表达及激活情况,应用TRAIL处理A20沉默或A20敲除的肝癌细胞系对肝细胞癌生长抑制作用、细胞周期影响和凋亡传导通路各蛋白表达情况影响。本研究旨在探讨联合应用TRAIL及A20基因沉默技术对肝癌细胞生长抑制和诱导凋亡的效果,并进一步探讨联合TRAIL和A20基因沉默技术增强肝癌细胞凋亡的分子机制,为肝细胞癌靶向治疗提供理论基础和实验依据。人肝癌组织及相关肿瘤细胞系中A20表达的检测结果如下:(1)A20在肝细胞癌组织标本中存在高表达,在正常肝组织中无表达或低表达。(2)A20在神经胶质瘤细胞系LN18中不表达,在结肠癌细胞系HCT-8和HT-29中低表达,在结肠癌细胞系DLD-1中中度表达,在神经胶质瘤细胞系LN443、肝癌细胞系HepG2和Hep3B中存在高表达。(3)A20在不同肿瘤中的表达情况存在组织和细胞类型的特异性,依据A20作为肿瘤分子治疗靶点的前提是针对特定肿瘤进行A20个性化机制研究。A20沉默增加肝癌细胞对TRAIL敏感性的实验研究结果如下:(1)TRAIL诱导的肝癌细胞凋亡被阻滞在caspase-8水平,A20-siRNA预处理后增加HepG2和Hep3B细胞对TRAIL的敏感性。(2)A20-siRNA与TRAIL联用在诱导肝癌细胞凋亡上有显著的协同作用,能有效逆转肝癌细胞对TRAIL的抵抗诱导凋亡。(3)A20-siRNA与TRAIL联用在诱导肝癌细胞凋亡机制是通过下调A20的表达,解除A20对RIP1的泛素化修饰,联合TRAIL可协同作用激活RIP1产生裂解带,逆转RIP1对caspase-8的抑制作用,进而解除RIP1对caspase-8蛋白酶体结构域的抑制作用,激活下游caspase-3,活化TRAIL诱导的死亡受体传导通路来实现的。A20对肝癌细胞生长作用的研究结果显示:(1)TRAIL在A20敲除HepG2和Hep3B细胞系中诱导凋亡的作用呈剂量依赖性。(2)A20介导的RIP1泛素化阻断TRAIL在肝细胞癌中诱导的caspase-8活化,而A20敲除则迅速逆转RIP1泛素化过程以增强TRAIL诱导的细胞凋亡。A20依赖性的RIP1泛素化可能是介导TRAIL凋亡耐受的一个重要机制。(3)A20敲除抑制早期传代肝癌细胞系的生长,并促使早期传代肝癌细胞系HepG2发生明显的形态学改变。A20参与了肝癌细胞的生长调控和形态学变化。本研究的主要创新点:(1)验证了A20和凋亡信号传导通路在肝癌组织和肝细胞癌细胞系中的表达情况,阐明了A20在不同肿瘤中的表达情况存在组织和细胞类型的特异性。(2)分子水平阐明了TRAIL诱导肝癌细胞凋亡受抑的分子机制;分析了A20参与肝癌细胞的生长调控和形态学变化的现象。(3)阐明了A20在肝细胞癌对TRAIL抵抗中的作用及联合应用TRAIL和A20沉默更好地抑制肝癌细胞生长、促进肝癌细胞凋亡的分子生物学机制。综上所述,A20在肝癌组织和肝癌细胞系中都存在高表达,A20在不同肿瘤中的表达情况存在组织和细胞类型的特异性。TRAIL诱导的肝癌细胞凋亡被阻滞在caspase-8水平,A20参与了肝癌细胞对TRAIL的抵抗。A20基因敲除后增加HepG2和Hep3B细胞对TRAIL的敏感性,与TRAIL联用在诱导肝癌细胞凋亡上有显著的协同作用,能有效逆转肝癌细胞对TRAIL的抵抗诱导凋亡,且TRAIL诱导凋亡的作用呈剂量依赖性。A20基因敲除与TRAIL联用诱导肝癌细胞凋亡机制是通过下调A20的表达,解除A20对RIP1的泛素化修饰,联合TRAIL可协同作用激活RIP1产生裂解带,逆转RIP1对caspase-8的抑制作用,进而解除RIP1对caspase-8蛋白酶体结构域的抑制作用,激活下游caspase-3,活化TRAIL诱导的死亡受体传导通路来实现的,A20依赖性的RIP1泛素化可能是介导TRAIL凋亡耐受的一个重要机制。同时A20还参与了肝癌细胞的生长调控和形态学变化。因此,联合使用TRAIL和A20基因沉默技术或靶向抑制剂可以更好的抑制肝癌细胞生长,激活下游凋亡传导通路诱导凋亡,为肝细胞癌的治疗提供了新的思路和方法。
中文摘要第7-10页
Abstract第10-13页
第1章 绪论第18-36页
    1.1 A20 的表达第21-22页
    1.2 A20 的结构第22-23页
    1.3 A20 抑制 NF-κB 活性第23-26页
    1.4 A20 的功能研究第26-31页
        1.4.1 A20 负性调控炎症第26-28页
        1.4.2 A20 调控体内抗病毒免疫第28-29页
        1.4.3 A20 调控细胞增殖、分化和死亡第29-31页
    1.5 A20 与疾病的关系第31-32页
        1.5.1 A20 与自身免疫性、炎症性疾病的关系第31-32页
        1.5.2 A20 与 B 细胞淋巴瘤第32页
        1.5.3 A20 在其他肿瘤中的作用第32页
    1.6 调控 A20 的机制第32-35页
        1.6.1 A20 表达量的调控第32-34页
        1.6.2 A20 的磷酸化功能修饰第34页
        1.6.3 A20 与其它蛋白的相互作用第34-35页
    1.7 展望第35-36页
第2章 人肝癌组织及相关肿瘤细胞系中 A20 表达的检测第36-46页
    2.1 材料与方法第36-41页
        2.1.1 主要仪器第36页
        2.1.2 实验材料及试剂第36-37页
        2.1.3 组织及细胞来源第37页
        2.1.4 主要试剂配制第37-38页
        2.1.5 实验方法第38-41页
    2.2 实验结果第41-45页
        2.2.1 人肝癌组织中 A20 的表达第41页
        2.2.2 人相关肿瘤细胞系中 A20 的表达第41-42页
        2.2.3 A20 在人类肉瘤中的表达第42页
        2.2.4 A20 在人类结直肠癌中的表达第42-43页
        2.2.5 A20 在人类胃腺癌中的表达第43-45页
    2.3 讨论第45-46页
第3章 A20沉默增加肝癌细胞对TRAIL敏感性的实验研究第46-58页
    3.1 材料与方法第46-50页
        3.1.1 主要仪器第46页
        3.1.2 实验材料及试剂第46-47页
        3.1.3 细胞来源第47页
        3.1.4 试剂及抗体来源第47-48页
        3.1.5 主要试剂配制第48页
        3.1.6 实验方法第48-50页
    3.2 实验结果第50-56页
        3.2.1 TRAIL 诱导的肝癌细胞凋亡被阻滞在 caspase-8 水平第50-52页
        3.2.2 A20 沉默增加肝癌细胞对 TRAIL 的敏感性第52-53页
        3.2.3 A20 沉默增强 TRAIL 诱导肝癌细胞凋亡的能力第53-54页
        3.2.4 A20 沉默可有效抑制肝癌细胞中 A20 的表达第54-55页
        3.2.5 A20 沉默联合 TRAIL 产生协同作用诱导肝癌细胞凋亡第55页
        3.2.6 A20 沉默联合 TRAIL 产生协同作用促进 RIP1 活化裂解第55-56页
    3.3 讨论第56-58页
第4章 A20 对肝癌细胞生长作用的研究第58-70页
    4.1 材料与方法第58-61页
        4.1.1 主要仪器第58页
        4.1.2 实验材料及试剂第58-59页
        4.1.3 细胞来源第59页
        4.1.4 试剂及抗体来源第59页
        4.1.5 主要试剂配制第59页
        4.1.6 实验方法第59-61页
    4.2 实验结果第61-67页
        4.2.1 稳定的 A20 敲除肝癌细胞系的建立第61页
        4.2.2 A20 敲除增加 TRAIL 诱导的肝癌细胞凋亡第61-64页
        4.2.3 A20 介导 RIP1 泛素化抑制 caspase-8 活化裂解第64-66页
        4.2.4 A20 对肝癌细胞生长和形态的影响第66-67页
    4.3 讨论第67-70页
第5章 结论第70-72页
参考文献第72-90页
作者简介及科研成果第90-91页
致谢第91页
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