新型蛋白质氧化折叠助剂的分子设计和复性方法研究

蛋白质氧化复性论文 离子交换介质论文 酶模拟物论文 酰基胱胺论文 包含体论文
论文详情
蛋白质复性是应用基因重组技术在菌体中生产贵重蛋白质的瓶颈。本文针对蛋白质复性过程的两个关键因素,二硫键形成和蛋白质聚集抑制,开展蛋白质氧化折叠助剂的分子设计和复性方法研究。针对二硫键形成问题,开展蛋白质氧化折叠动力学研究,揭示二硫键形成是折叠过程中色氨酸包埋的前提条件,发现混合二硫键的形成是控制第一折叠相折叠速率的关键因素。在此基础上开展氧化折叠助剂的分子设计。首先考察蛋白质二硫键异构酶(PDI)和DsbA的结构特性,发现其活性位点周围具有疏水性表面。因此,设计具有疏水尾的小分子折叠酶模拟物酰基胱胺作为新型氧化折叠助剂分子。研究表明,酰基胱胺能够在强还原环境下有效地促进蛋白质氧化复性,这是其它任何氧化剂所不能做到的。并且,酰基胱胺能够极大地提高蛋白质氧化复性速率,在较低浓度下依然有效,仅需胱胺浓度的一半即可获得相同的复性效果。其作用机理研究发现,酰基胱胺通过疏水烷基链介导与变性蛋白质之间形成疏水相互作用,获得其促进复性的显著效果。其次,研究发现PDI的模拟分子氧化型寡肽CGC作为氧化折叠助剂可显著提高蛋白质氧化复性的速率和收率。以此为基础设计新型氧化折叠助剂分子RKCGC。研究表明,RKCGC能够与二硫苏糖醇很好地耦合,促进二硫键的形成和异构,具有较宽的适用pH范围。且与CGC相比,RKCGC能够更好地提高氧化复性的速率和收率。其作用机理研究发现,RKCGC具有更低的pKa值和更高的还原势,因而获得较好的辅助复性效果。针对蛋白质聚集问题,开展抑制聚集方法研究,发现与蛋白质带有同种电荷的离子交换介质能够很好地抑制折叠中间体聚集从而促进蛋白质复性。通过四种带不同电荷的离子交换介质对三种带不同电荷的蛋白质辅助复性研究,证实同电荷离子交换介质能够有效促进蛋白质复性,且在高蛋白质浓度(4 mg/mL溶菌酶;2 mg/mL牛血清白蛋白)条件其促进复性效果依然非常显著,而且不会降低复性速率,优于其它化学添加剂。其作用机理研究发现,同电荷离子交换介质通过静电斥力诱导蛋白质在其带电表面形成定向排列,从而抑制聚集。进而将该方法应用到重组增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的复性中,发现EGFP包含体的复性收率提高近一倍,并且在辅助复性的同时还具有纯化的效果。在同电荷离子交换介质辅助复性的基础上拓展研究工作,提出同电荷聚电解质辅助蛋白质复性方法。通过比较聚电解质与离子交换介质的作用机制,揭示溶液中的存在形态是影响同电荷物质促进蛋白质复性效果的关键因素。
中文摘要第3-4页
ABSTRACT第4-5页
第一章 文献综述第10-34页
    1.1 蛋白质折叠复性第10-14页
        1.1.1 体内蛋白质折叠第10-11页
        1.1.2 体外蛋白质折叠复性第11页
        1.1.3 影响蛋白质复性的关键因素第11-14页
    1.2 体内蛋白质折叠的辅助因子第14-22页
        1.2.1 促进蛋白质二硫键形成的氧化还原酶第14-18页
        1.2.2 抑制蛋白质聚集的分子伴侣第18-22页
    1.3 辅助蛋白质复性的小分子第22-27页
        1.3.1 促进蛋白质二硫键形成的氧化还原剂小分子第22-23页
        1.3.2 抑制蛋白质聚集的小分子第23-27页
    1.4 色谱辅助复性第27-32页
        1.4.1 凝胶过滤色谱第27-28页
        1.4.2 离子交换色谱第28-29页
        1.4.3 疏水相互作用色谱第29-30页
        1.4.4 固定化金属离子亲和色谱第30页
        1.4.5 固定化辅助复性因子色谱第30-32页
    1.5 本文研究内容第32-34页
第二章 二硫键形成对蛋白质折叠动力学的影响第34-44页
    2.1 引言第34页
    2.2 实验材料和方法第34-36页
        2.2.1 实验材料第34-35页
        2.2.2 溶菌酶的还原变性第35页
        2.2.3 折叠动力学实验第35-36页
        2.2.4 强度平均波长变化动力学第36页
        2.2.5 酶活测定第36页
    2.3 结果与讨论第36-43页
        2.3.1 二硫键形成的作用研究第36-39页
        2.3.2 第一相构象折叠动力学第39-42页
        2.3.3 第二相构象折叠速率的决定因素第42-43页
    2.4 小结第43-44页
第三章 蛋白质折叠酶模拟物酰基胱胺的设计及其辅助蛋白质复性第44-59页
    3.1 引言第44-45页
    3.2 实验部分第45-49页
        3.2.1 实验材料第45页
        3.2.2 酰基胱胺的制备和表征第45-47页
        3.2.3 蛋白质的还原变性第47页
        3.2.4 内源荧光动力学测定方法第47-48页
        3.2.5 氧化复性的活性动力学第48页
        3.2.6 酶活测定第48-49页
        3.2.7 临界胶团浓度的测定第49页
    3.3 实验结果与讨论第49-57页
        3.3.1 辛酰胱胺的氧化能力考察第49-52页
        3.3.2 辛酰胱胺氧化能力的根源分析第52-54页
        3.3.3 烷基链长度对酰基胱胺氧化能力的影响第54-55页
        3.3.4 己酰胱胺对高浓度蛋白质氧化复性的影响第55-57页
    3.4 小结第57-59页
第四章 折叠酶模拟物寡肽的设计及其促进蛋白质复性第59-75页
    4.1 前言第59-60页
    4.2 实验材料和方法第60-63页
        4.2.1 实验材料第60页
        4.2.2 分析测试仪器第60页
        4.2.3 蛋白质还原变性第60页
        4.2.4 蛋白质复性动力学实验第60-61页
        4.2.5 酶活测定第61页
        4.2.6 还原势的测定第61-62页
        4.2.7 巯醇pK_a 值的测定第62-63页
    4.3 实验结果与讨论第63-73页
        4.3.1 氧化型CGC 辅助蛋白质氧化复性第63-67页
        4.3.2 RKCGC 的设计第67-68页
        4.3.3 中性条件下RKCGC 的辅助复性效果第68-71页
        4.3.4 弱碱性条件下RKCGC 的辅助复性效果第71-73页
    4.4 小结第73-75页
第五章 同电荷离子交换介质促进蛋白质复性第75-92页
    5.1 引言第75-76页
    5.2 实验材料和方法第76-79页
        5.2.1 实验材料第76页
        5.2.2 凝胶的准备和性质确定第76页
        5.2.3 孔隙率的确定第76-77页
        5.2.4 蛋白质的变性及还原变性第77-78页
        5.2.5 复性实验第78页
        5.2.6 复性后蛋白质检测第78-79页
        5.2.7 Zeta 电势的测定第79页
        5.2.8 蛋白质静电势的计算第79页
    5.3 结果与讨论第79-91页
        5.3.1 离子交换介质辅助带正电荷蛋白质Lysozyme 的复性第79-81页
        5.3.2 离子交换介质辅助带负电荷蛋白质BSA 的复性第81-82页
        5.3.3 离子交换介质辅助带负电荷蛋白质 CAII 的复性第82-83页
        5.3.4 同电荷离子交换介质促进复性的机制第83-85页
        5.3.5 同种电荷介质抑制聚集作用和尿素的耦合第85-87页
        5.3.6 介质-蛋白质间静电斥力对介质抑制聚集效果的影响第87-89页
        5.3.7 同电荷介质抑制蛋白质聚集的可能机制第89-91页
    5.4 小结第91-92页
第六章 同电荷聚电解质促进蛋白质复性第92-109页
    6.1 引言第92-93页
    6.2 实验材料和方法第93-95页
        6.2.1 实验材料第93页
        6.2.2 聚电解质的准备第93页
        6.2.3 蛋白质的变性及还原变性第93-94页
        6.2.4 复性实验第94页
        6.2.5 复性后蛋白质检测第94-95页
        6.2.6 Zeta 电势的测定第95页
    6.3 结果与讨论第95-107页
        6.3.1 阳离子型聚电解质辅助带正电荷蛋白质Lysozyme 的复性第95-101页
        6.3.2 阳离子型聚电解质辅助带正电荷蛋白质RNase A 的复性第101页
        6.3.3 阳离子聚电解质辅助带负电荷蛋白质CAⅡ 的复性第101-104页
        6.3.4 阴离子聚电解质 ES100 辅助 CAII 的复性第104-105页
        6.3.5 阴离子聚电解质硫酸葡聚糖辅助 CAII 的复性第105-106页
        6.3.6 阴离子聚电解质ES100 辅助带负电荷蛋白质EGFP 的复性第106-107页
    6.4 小结第107-109页
第七章 同电荷离子交换介质促进包含体蛋白质的复性第109-126页
    7.1 引言第109-110页
    7.2 实验材料和方法第110-116页
        7.2.1 实验材料第110页
        7.2.2 重组绿色荧光蛋白包含体的表达和纯化第110-111页
        7.2.3 包含体中目标蛋白质百分含量的确定第111-113页
        7.2.4 总蛋白质含量的测定第113-114页
        7.2.5 活性EGFP 的纯化第114-115页
        7.2.6 活性EGFP 蛋白的荧光标曲测定第115页
        7.2.7 EGFP 包含体的变性第115页
        7.2.8 EGFP 包含体的复性第115-116页
        7.2.9 凝胶过滤色谱法测定EGFP 复性的过程第116页
    7.3 结果与讨论第116-124页
        7.3.1 EGFP 包含体表达及纯化结果第116-117页
        7.3.2 SP Sepharose FF 辅助EGFP 包含体复性第117-119页
        7.3.3 同电荷离子交换介质对蛋白质的纯化效果第119-122页
        7.3.4 SP Sepharose FF 辅助复性的过程第122-124页
    7.4 小结第124-126页
第八章 结论与展望第126-130页
    8.1 全文总结第126-128页
    8.2 创新点第128页
    8.3 对今后工作的建议与展望第128-130页
参考文献第130-144页
发表论文和科研情况说明第144-147页
附录第147-153页
    附录一. 培养基配方第147页
    附录二. 包含体处理所用缓冲液第147页
    附录三. SDS-PAGE凝胶电泳所用试剂第147-148页
    附录四 EGFP荧光标准曲线第148-149页
    附录五 介质上洗脱的杂质蛋白样品的液质联用谱图第149-153页
致谢第153页
论文购买
论文编号ABS538507,这篇论文共153页
会员购买按0.30元/页下载,共需支付45.9
不是会员,注册会员
会员更优惠充值送钱
直接购买按0.5元/页下载,共需要支付76.5
只需这篇论文,无需注册!
直接网上支付,方便快捷!
相关论文

点击收藏 | 在线购卡 | 站内搜索 | 网站地图
版权所有 艾博士论文 Copyright(C) All Rights Reserved
版权申明:本文摘要目录由会员***投稿,艾博士论文编辑,如作者需要删除论文目录请通过QQ告知我们,承诺24小时内删除。
联系方式: QQ:277865656