BM-MSCs移植治疗AMI大鼠模型的疗效及其机制的研究

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目的:观察间充质干细胞(MSCs)移植治疗大鼠急性心肌梗死(AMI)的可行性,评价普通MSCs和经生长因子预处理的MSCs (GF-MSCs)移植对AMI大鼠模型心脏形态结构及功能的影响,并探讨其治疗作用的机制。方法:1、建立大鼠心肌梗死模型:30只雌性SD大鼠随机分成AMI组和Sham组,AMI组大鼠结扎前降支,建立AMI模型;Sham组为假手术组。术后4周行超声心动和血流动力学检查,处死后留心脏标本作病理学检查。而后,应用该方法再次制作AMI雌性大鼠模型39只备用。2、大鼠BM-MSCs的分离、培养和扩增及GF-MSCs的培养和扩增:MSCs分离、培养扩增后,应用流式细胞仪检测MSCs表型;GF-MSCs培养扩增后,免疫荧光染色和RT-PCR检测TnI和Des的表达;检测MSCs和GF-MSCs的细胞周期;应用ELISA检测HGF和VEGF在MSCs和GF-MSCs细胞裂解液及培养上清中的蛋白浓度。3、MSCs和GF-MSCs移植治疗AMI大鼠模型:将AMI大鼠模型39只随机分成MSCs组、GF-MSCs组和NS组,每组13只,分别心肌内注射CM-Dil标记的MSCs、GF-MSCs或生理盐水,细胞移植4周后观察:(1)各组大鼠一般情况;(2)超声心动指标;(3)血流动力学指标;(4)形态学与病理学改变。4、细胞移植治疗作用机制:(1)RT-PCR检测心肌组织Y染色体;(2)免疫荧光染色检测心肌组织TnI和Des的表达;(3)RT-PCR检测心肌组织MMP2、MMP9、TIMP1、SDF1-α、Tn1和Des mRNA的表达水平;(4)ELISA检测心肌组织TNF-αVEGF和HGF蛋白含量;(5) TUNEL凋亡分析;Western Blot检测Caspase 3表达水平;(6)检测心肌氧化应激水平。结果:1、结扎大鼠前降支建立AMI模型:(1)与Sham组相比,AMI组大鼠的LVEDD和LVESD增大,LVEF和FS减低(P<0.01);]LVSP、+dP/dtmax、-dP/dtmax降低,LVEDP升高(P<0.01)。(2)HE染色显示AMI组大鼠心肌纤维排列紊乱、断裂或肥大,部分心肌细胞丢失、呈空泡变性,间质水肿,心肌纤维间散在淋巴细胞浸润;Sham组大鼠心肌组织大致正常。Masson染色显示AMI组大鼠心肌胶原纤维明显增多,Sham组大致正常。2、体外MSCs及GF-MSCs的培养扩增:(1)MSCs呈梭形、贴壁生长,并表达CD105、CD44、CD29,而不表达CD31和CD34、D45;体外培养的GF-MSCs贴壁生长,细胞呈梭形或多角形,形态与诱导前的MSCs相似,免疫荧光染色和RT-PCR结果显示TnI和Des表达阳性。(2)细胞周期分析发现MSCs G1期细胞的比例高于GF-MSCs (P<0.05),而G2期和S期细胞的比例低于GF-MSCs (P<0.05)。(3) HGF和VEGF在细胞裂解液以及细胞培养上清中的蛋白浓度,GF-MSCs高于MSCs (P<0.01)。3、细胞移植疗效:(1)细胞移植4周后,各治疗组均无大鼠死亡。MSCs组和GF-MSCs组大鼠的一般状况较NS组好。NS组心脏重量/体质量比值高于MSCs组和GF-MSCs组(P<0.05)。(2)与NS组相比,MSCs组和GF-MSCs组大鼠的LVEDD和LVESD减小,LVEF和FS升高(P<0.01);与MSCs组比较,GF-MSCs组的LVEDD和LVESD减小,LVEF和FS升高(P<0.05)(3)与NS组相比,MSCs组和GF-MSCs组大鼠的LVSP、+dP/dtmax、-dP/dtmax升高,LVEDP降低(P<0.01);与MSCs组比较,GF-MSCs组的LVSP、+dP/dtmaX、-dP/dtmax升高,LVEDP降低(P<0.05)。(4)HE染色显示,NS组大鼠心肌纤维排列紊乱、肥大,间质水肿、淋巴细胞浸润明显;MSCs组和GF-MSCs组大鼠心肌间质淋巴细胞浸润较少。(5)Masson染色显示,NS组大鼠心肌胶原纤维明显多于MSCs组和GF-MSCs组;大鼠心肌纤维化面积比率定量分析,NS组高于MSCs组(36.27±1.65%vs 17.32±1.08%,P<0.01)和GF-MSCs组(36.27±1.65%vs 7.26±0.42,P<0.01),GF-MSCs组低于MSCs组(7.26±0.42% vs 17.32±1.08%,P<0.01)。4、细胞治疗作用机制:(1)Y染色体mRNA在雌性AMI大鼠模型MSCs组和GF-MSCs组的心肌组织内均有表达。(2)CM-Dil标记细胞在MSCs组和GF-MSCs组大鼠的心肌组织中TnI和Des免疫荧光染色均阳性;心肌组织中TnI和Des mRNA表达水平,MSCs组和GF-MSCs组高于NS组(P<0.01),GF-MSCs组高于MSCs组(P<0.01)。(3)心肌组织中TNF-a的蛋白含量,NS组高于MSCs组和GF-MSCs组(P<0.01),GF-MSCs组低于MSCs组(P<0.01)。(4)心肌组织MMP2 mRNA表达水平,NS组低于MSCs组和GF-MSCs组(P>0.05);MMP9和TIMP1 mRNA表达水平,NS组高于MSCs组和GF-MSCs组(P<0.01),GF-MSCs组低于MSCs组(P<0.01)。(5)心肌组织SDF1-α的mRNA表达水平,NS组低于MSCs组和GF-MSCs组(P<0.01),GF-MSCs组高于MSCs组(P<0.01);心肌组织中VEGF和HGF蛋白含量,NS组低于MSCs组和GF-MSCs组(P<0.01),GF-MSCs组高于MSCs组(P<0.01)。(6)心肌细胞凋亡指数,NS组高于MSCs组和GF-MSCs组(P<0.01),GF-MSCs组低于MSCs组(P<0.01);Western Blot检测心肌组织中Caspase-3蛋白表达水平,NS组高于MSCs组和GF-MSCs组, GF-MSCs组低于MSCs组(P<0.01)。(7)心肌组织总超氧化物歧化酶(T-SOD)活力,NS组低于MSCs组和GF-MSCs组(P<0.01),GF-MSCs组高于MSCs组(P<0.01)。丙二醛(MDA)含量,NS组高于MSCs组和GF-MSCs组(P<0.01), GF-MSCs组低于MSCs组(P<0.01)。结论:1、结扎大鼠冠状动脉左前降支可成功建立急性心肌梗死(AMI)大鼠模型。2、体外3种生长因子(BMP-2、FGF-2和IGF-1)预处理能诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)向心肌样细胞分化,并增强其旁分泌能力。3、直接心肌内注射MSCs能在一定程度上改善心肌梗死大鼠的心脏结构和心功能,可能与MSCs发挥旁分泌作用,减轻AMI大鼠心肌组织炎症反应、减少心肌纤维化、降低心肌细胞凋亡、减轻心肌氧化应激反应有关。4、经生长因子预处理的大鼠BM-MSCs (GF-MSCs)治疗效果优于普通MSCs,其作用机制可能为:生长因子预处理可促进MSCs(?)心肌样细胞分化,增强其旁分泌效应,增加心肌功能蛋白mRNA表达,使得GF-MSCs抑制心肌炎症反应、减少心肌纤维化、抗细胞凋亡和减轻心肌氧化应激反应的作用强于普通MSCs。
中文摘要第4-7页
Abstract第7-11页
缩略语/符号说明第16-18页
前言第18-20页
    研究现状、成果第18-19页
    研究目的、方法第19-20页
一、大鼠心肌梗死模型的建立第20-29页
    1.1 材料与方法第20-24页
        1.1.1 实验动物第20页
        1.1.2 实验试剂及器械设备第20页
        1.1.3 心肌梗死大鼠模型的建立第20-21页
        1.1.4 心肌梗死大鼠模型的检测第21-24页
        1.1.5 统计学方法第24页
    1.2 结果第24-27页
        1.2.1 死亡率及一般情况第24页
        1.2.2 超声心动检测结果第24-25页
        1.2.3 血流动力学检测结果第25页
        1.2.4 形态学和病理学改变第25-27页
    1.3 讨论第27-28页
        1.3.1 麻醉第27页
        1.3.2 呼吸控制及肺的保护第27-28页
        1.3.3 冠状动脉前降支的定位和结扎第28页
    1.4 小结第28-29页
二、MSCs的培养扩增和诱导分化第29-48页
    2.1 材料与方法第29-39页
        2.1.1 实验动物第29页
        2.1.2 主要仪器及试剂第29-31页
        2.1.3 主要溶液的配制第31-32页
        2.1.4 大鼠骨髓来源的MSCs分离培养和诱导分化第32-34页
        2.1.5 流式细胞仪检测细胞表型和细胞周期第34页
        2.1.6 免疫荧光染色第34-35页
        2.1.7 逆转录酶-聚合酶链式反应第35-37页
        2.1.8 细胞因子在细胞裂解液以及细胞培养上清蛋白表达第37-39页
        2.1.9 统计学方法第39页
    2.2 结果第39-44页
        2.2.1 MSCs形态第39-40页
        2.2.2 流式细胞仪鉴定细胞表型结果第40页
        2.2.3 生长因子诱导MSC向心肌细胞分化第40-41页
        2.2.4 GF-MSCs免疫荧光检测结果第41-42页
        2.2.5 RT-PCR检测细胞TNI和Des mRNA的表达结果第42页
        2.2.6 细胞周期测定结果第42-43页
        2.2.7 细胞因子检测结果第43-44页
    2.3 讨论第44-47页
        2.3.1 骨髓来源MSCs的提取第44-45页
        2.3.2 MSCs的鉴定第45页
        2.3.3 体外诱导MSCs向心肌样细胞分化第45-46页
        2.3.4 生长因子预处理对MSCs细胞周期的影响第46页
        2.3.5 生长因子预处理增强MSCs的旁分泌功能第46-47页
    2.4 小结第47-48页
三、细胞移植治疗心肌梗死大鼠模型的疗效第48-58页
    3.1 材料与方法第48-52页
        3.1.1 实验动物第48页
        3.1.2 主要仪器与主要试剂第48-49页
        3.1.3 细胞移植治疗AMI大鼠模型第49-51页
        3.1.4 细胞移植后疗效评价第51-52页
        3.1.5 统计学方法第52页
    3.2 结果第52-55页
        3.2.1 CM-Dil标记的MSC第52页
        3.2.2 各组大鼠一般情况第52-53页
        3.2.3 超声心动图检测结果第53页
        3.2.4 血流动力学检测结果第53页
        3.2.5 形态学和病理学改变第53-55页
    3.3 讨论第55-57页
        3.3.1 细胞移植时机和移植途径第55页
        3.3.2 移植MSCs对心脏结构和功能的影响第55-56页
        3.3.3 移植MSCs存活及分化第56-57页
        3.3.4 移植MSCs对心肌组织炎症反应的影响第57页
        3.3.5 移植MSCs对心肌纤维化的影响第57页
    3.4 小结第57-58页
四、细胞治疗作用机制第58-82页
    4.1 材料与方法第58-68页
        4.1.1 实验仪器与试剂第58-59页
        4.1.2 免疫荧光染色第59-60页
        4.1.3 心肌细胞凋亡的原位检测第60-61页
        4.1.4 半定量逆转录酶聚合酶链式反应第61-64页
        4.1.5 心肌组织TNF-α、VEGF和HGF含量检测第64页
        4.1.6 免疫蛋白印迹分析第64-67页
        4.1.7 心肌氧化应激水平测定第67-68页
        4.1.8 统计学方法第68页
    4.2 结果第68-75页
        4.2.1 免疫荧光检测结果第68-70页
        4.2.2 SQRT-PCR结果第70-73页
        4.2.3 ELISA结果第73页
        4.2.4 TUNEL凋亡分析结果第73-74页
        4.2.5 Western Blot检测结果第74页
        4.2.6 氧化应激水平检测结果第74-75页
    4.3 讨论第75-81页
        4.3.1 MSCs在心肌组织存活并分化为心肌样细胞第75-77页
        4.3.2 MSCs减轻心肌组织炎症反应作用机制第77页
        4.3.3 MSCs影响心肌纤维化的的作用机制第77-79页
        4.3.4 MSCs对心肌细胞凋亡的影响第79页
        4.3.5 MSCs对心肌组织氧化应激反应的影响第79-80页
        4.3.6 MSCs旁分泌效应第80-81页
    4.4 小结第81-82页
论文局限性第82-83页
全文结论第83-84页
论文创新点第84-85页
参考文献第85-96页
发表论文和参加科研情况说明第96-97页
综述    干细胞治疗年龄相关性心脑血管病研究进展第97-112页
    综述参考文献第105-112页
致谢第112页
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