S100A6表达下调细胞株的建立及S100A6与胃癌细胞株SGC7901多药耐药的相关性研究

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研究背景:胃癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一,其治疗主要依靠手术切除和系统的辅助治疗。系统的辅助治疗,特别是化疗在胃癌的治疗中有举足轻重的地位,成功的化疗可以有效的抑制原发病灶的复燃和远处转移,大大的改善患者的预后,提高患者的远期生存。然而由于肿瘤多药耐药(multidrug resistance MDR)的产生,化疗的效果并不尽人意。因此深入研究胃癌多药耐药产生的机制,是当前胃癌研究的重点之一。此前本课题组以人胃癌细胞株SGC7901、阿霉素的耐药细胞株SGC7901/ADR和丹参逆转后的耐药细胞株为研究对象,应用蛋白质组学技术和高效液相色谱-电喷雾电离串联质谱(HPLC-ESIMS/MS)方法对部分有差异的蛋白进行分析,结果发现S100A6在SGC7901细胞和丹参逆转后的耐药细胞株中呈高表达,而在耐药细胞株SGC7901/ADR中低表达。为验证上述实验结果,其后又应用免疫细胞化学、Western-blot,检测S100A6蛋白在SGC7901和SGC7901/ADR细胞中的表达水平,结果均显示S100A6在SGC7901细胞中高表达,而在SGC7901/ADR中低表达。然而,运用RT-PCR技术检测mRNA水平两种细胞S100A6表达差异时发现:mRNA水平S100A6在以上两种细胞中的表达量无显著性差异。为了进一步研究S100A6与胃癌MDR的关系,课题组构建了S100A6-shRNA真核表达质粒并筛选出最有效的RNA干扰靶点。目的:本实验以人胃癌细胞株SGC7901为研究对象,以RNA干扰技术将干扰效率最高的shRNA-1和shRNA-3质粒并阴性对照NC质粒转染入SGC7901细胞,建立S100A6低表达shRNA质粒稳定转染的SGC7901细胞株,为进一步探讨S100A6与胃癌MDR的关系奠定基础。方法:将干扰效率较高的shRNA-1、shRNA-3质粒和阴性对照NC质粒转化入DH5α感受态大肠杆菌。经选择性LB固体培养基(含卡那霉素)筛选,挑选单菌落,扩增质粒。培养人胃癌细胞株SGC7901,确定G418筛选的最佳浓度。应用脂质体转染法将重组质粒转染到SGC7901细胞中,经压力浓度的G418筛选培养40天,收获稳定传代的转染细胞。将shRNA-1质粒稳转细胞、shRNA-3质粒稳转细胞、NC质粒稳转细胞、SGC7901细胞、SGC7901/ADR细胞进行传代培养,分别接种入六孔板,细胞爬片,将爬片用SP法进行免疫细胞化学染色,观察染色情况记录结果。传代培养以上五种细胞,当细胞状态良好并接近汇合时,每种细胞取2瓶提取其细胞总蛋白,测定蛋白浓度。同样方法培养细胞,每种细胞取2瓶提取细胞的总mRNA,测定浓度。然后以western-blot和RT-PCR的方法,分别从蛋白和mRNA水平分析S100A6在这五种细胞中的表达差异。CCK8试验,每种细胞分7组,每组5个复孔,以1×104个/ml细胞密度,100ul/孔,接种96孔板并正常培养24h。按ADR终浓度配制六个梯度的培养液。每种细胞的七组分别加入以上六个梯度浓度的培养液和普通培养液,培养48h,加入CCK810ul/孔,继续培养4h,测定每孔在450nm处的OD值,计算每种细胞的IC50(药物半抑制浓度)、RI(耐药指数)。结果:1.得到了稳定传代的shRNA-1、shRNA-3、NC质粒稳转细胞株。2.免疫细胞化学结果: SGC7901细胞、NC质粒稳转细胞胞浆胞膜深染呈棕褐色-棕黄色,染色强阳性(+++),S100A6呈高表达; shRNA-1质粒稳转细胞、shRNA-3质粒稳转细胞及SGC7901/ADR细胞胞浆胞膜染色呈淡黄色,染色弱阳性(+),S100A6呈低表达。3.western-blot结果:S100A6蛋白在SGC7901细胞、NC质粒稳转细胞、SGC7901/ADR细胞、shRNA-1质粒稳转细胞、shRNA-3质粒稳转细胞平均表达量为0.97±0.08、0.93±0.07、0.78±0.03、0.68±0.03、0.74±0.05。单因素方差分析做五种细胞的两两比较,SGC7901细胞与SGC7901/ADR细胞、shRNA-1质粒稳转细胞及shRNA-3质粒稳转细胞三种细胞比较,p均小于0.05,差异性显著;SGC7901细胞与NC质粒稳转细胞比较,p大于0.05,差异性不显著。4.RT-PCR结果: S100A6基因mRNA在SGC7901细胞、NC质粒稳转细胞、SGC7901/ADR细胞、shRNA-1质粒稳转细胞、shRNA-3质粒稳转细胞中的平均表达量分别为0.975±0.006、0.961±0.034、0.935±0.027、0.768±0.088、0.806±0.055。单因素方差分析做五种细胞两两比较,SGC7901细胞与SGC7901/ADR细胞、NC质粒稳转细胞比较,p值均大于0.05,差异性不显著;SGC7901细胞与shRNA-1质粒稳转细胞、shRNA-3质粒稳转细胞比较,p值均小于0.05,差异性显著。5.CCK8试验:ADR作用下SGC7901/ADR细胞、SGC7901细胞、shRNA-1质粒稳转细胞、shRNA-3质粒稳转细胞、NC质粒稳转细胞的IC50分别为1.288±0.168ug/ml、0.336±0.045ug/ml、0.564±0.084ug/ml、0.402±0.001ug/ml、0.342±0.041ug/ml。单因素方差分析做五种细胞的两两比较,SGC7901/ADR细胞与其他四种细胞相比P值均小于0.05,差异性显著。SGC7901细胞与shRNA-1质粒稳转细胞相比P值小于0.05,差异性显著;SGC7901细胞与shRNA-3质粒稳转细胞和NC质粒稳转细胞相比较,P值大于0.05,差异性不显著。结论:1. shRNA-1质粒的靶点序列是本实验干扰效率最高的靶点序列,可以有效的干扰SGC7901细胞中S100A6表达。2.人S100A6基因shRNA真核表达质粒能跟随SGC7901细胞稳定传代,并特异性抑制SGC7901细胞中S100A6mRNA和蛋白的表达,建立了新细胞株。3.通过比较S100A6蛋白在shRNA真核表达质粒稳转细胞、SGC7901细胞、SGC7901/ADR细胞中的差异性表达及以上细胞耐药性的变化表明,S100A6蛋白可能与胃癌MDR的产生有一定关系。
摘要第6-9页
Abstract第9-12页
前言第13-14页
材料与方法第14-26页
    一、实验材料第14-17页
        1.1 研究对象第14页
        1.2 主要试剂第14-15页
        1.3 主要器材第15-16页
        1.4 主要试剂的配制第16-17页
    二、实验方法第17-26页
        2.1 细胞系和细胞培养第17页
        2.2 质粒扩增第17-19页
        2.3 转染和稳定转染细胞的筛选第19-20页
        2.4 免疫细胞化学第20-21页
        2.5 蛋白质免疫印迹分析(western--blot)第21-23页
        2.6 RT-RCR第23-25页
        2.7 细胞增殖-毒性检测第25-26页
        2.8 统计学分析第26页
实验结果第26-33页
    一、重组质粒稳定转染的 SGC7901 细胞第26-27页
    二、免疫细胞化学结第27-28页
    三、Western-blot 结果第28-29页
    四、RT-PCR 结果第29-31页
    五、CCK8 试验结果第31-33页
讨论第33-38页
结论第38-39页
参考文献第39-42页
综述第42-56页
    参考文献第49-56页
致谢第56-57页
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