柑橘是世界第一大果树,栽培历史悠久,其鲜果和果汁具有重要的经济价值。然而,柑橘育种面临着极大的挑战,如大多数重要性状为复杂的数量性状、世代周期长、遗传背景复杂、无融合生殖和配子体不育现象普遍等。利用分子标记技术进行遗传图谱的构建和QTL定位研究,能找到与育种目标性状紧密连锁的或共分离的标记,利用分子标记辅助选择育种技术可极大的缩短育种年限、提高育种定向性和效率。本研究首先基于克里曼丁橘的全基因组序列开发了大量的共显性SSR标记,并且基于枳基因组重测序数据大规模的开发了可靠的Indel标记,为柑橘的进一步遗传研究提供了宝贵的资源;然后以克里曼丁橘和枳为亲本进行杂交,构建了F1分离群体,利用SSR标记、Indel标记和结合简化基因组测序技术开发的SNP标记,构建了柑橘的高密度遗传连锁图谱;最后对后代落叶分离表型进行QTL定位分析,首次分析了控制枳落叶性状的QTL位点。主要研究结果如下:1.从数据库中获得克里曼丁橘全基因组信息,通过MISA软件共找到80,708个SSR位点,平均密度为268个/Mb,二核苷酸和三核苷酸基序重复类型最多。对33,929个转录组序列进行分析,发现6,834个转录本序列共包含8,989个SSR位点,然后对这些转录本进行了功能注释和不同基序重复类型进行了统计。2.利用获得的SSR位点进行标记开发,设计了105对引物(27个SSR位于genomic和78个位于CDs区域)。对柑橘三大属的18个不同种进行鉴定,获得95个稳定性好、多态性高的SSR标记(成功的标记占比为90.5%)。进一步聚类分析表明,18个柑橘种聚为三大类,各种间聚类结果与前期的研究报道相一致。3.对克里曼丁橘和枳的杂交后代(CP)和枳(PT)进行了基因组深度重测序(测序深度分别为22.86 X和25.98 X)。通过比对,CP中得到了2,591,103个SNP位点,PT中获得了3,105,640个SNP位点,共同的SNP位点有503,132个。此外,CP中得到了722,298个Indel位点,PT中获得了895,643个Indel位点,CP与PT共有的Indel位点有157,471个。4.随机筛选了82个Indel位点并在其两端设计引物,对柑橘三属的32份不同种进行鉴定,最终获得了74个稳定性好、有多态性的Indel标记(去掉无效扩增和无多态性的标记)。进一步聚类分析表明,各种间聚类分析结果与前人的研究报道相一致。结果表明,基于枳基因组深度重测序开发的Indel标记效率(90.24%)和可靠性均较高。5.利用SSR和Indel标记并结合简化基因组测序技术开发的SNP标记,分别构建了双亲的高密度遗传连锁图谱,以及双亲整合的遗传图谱。其中,母本遗传图谱共包含1,491个标记,总图距为1773.53 c M,平均图距为1.19 c M;父本遗传图谱共包含2,980个标记,总图距为1530.88 c M,平均图距为0.51 c M;而双亲整合后的遗传图谱共包含4,179个标记,总图距为1770.37 c M,平均图距为0.42c M。SNP标记统计表明,偏分离标记所占总标记的比例相比于前期的研究稍微偏高;对物理图谱和遗传图谱共线性分析表明构建图谱质量较高,并发现了几个明显的重组热点区域。6.对后代落叶分离表型进行了观察,获得了两年的表型数据,结合构建的遗传连锁图谱,进行落叶性状的QTL定位。再次,利用Mutmap方法定位了染色体1和8上两个区间,区间大小分别为1.37 Mb和0.67 Mb,并且分别包含36个和107个基因。其中,染色体8上定位区间更加显著,具有更大的基因密度。7.对2个定位区间的共143个候选基因组进行了功能注释,并在贡献值较大的染色体8上定位区间验证了几个与表型连锁的Indel标记,并进一步缩小了染色体8上的关联区间范围。由于枳的落叶性与冬季低温关系密切,本研究进一步对枳幼苗进行低温处理,根据功能注释和前期的转录组数据,在染色体1和8定位区间内分别筛选了7和23个候选基因,并利用q RT-PCR验证了候选基因在低温诱导下的表达模式。结果表明,12个基因受低温胁迫诱导后表达显著升高,2个基因下调表达显著,而剩余的16个基因表达变化不明显,这些结果为进一步获得落叶关联基因奠定了基础。
