γ-谷氨酰转肽酶是一种异源二聚体酶,广泛存在于微生物和哺乳动物体内,参与γ-谷氨酰类物质的代谢。γ-谷氨酰转肽酶催化γ-谷氨酰类化合物如谷胱甘肽等的γ-谷氨酰键断裂,并且能够转移γ-谷氨酰基到其它的氨基酸或者肽类物质上。γ-谷氨酰转肽酶催化γ-谷氨酰基转移的反应在医药、食品和保健领域具有广泛的应用,许多功能性的食品和药品如谷胱甘肽、茶氨酸和γ-谷氨酰牛磺酸等可以通过γ-谷氨酰基转移反应来合成。微生物来源的γ-谷氨酰转肽酶具有底物专一性广泛、反应不需额外能量和γ-谷氨酰基供体来源容易等优点,是催化反应中酶的主要来源。而微生物γ-谷氨酰转肽酶的产量不足,是限制其催化转肽反应应用的主要问题。γ-谷氨酰甲胺是存在微生物和植物体内的一种非蛋白氨基酸,具有显著减低血压的生理功能。目前其生物合成的方法存在催化合成酶的来源麻烦、反应过程需要额外的能量等问题,限制了其在食品保健领域的应用,需要寻找新的方法来有效合成γ-谷氨酰甲胺。本研究以实验室保藏的一株产γ-谷氨酰转肽酶的微生物Bacillus subtilis SK11.004为基础,首先通过分析培养基营养成分对细胞产酶的影响及环境因素对细胞产酶的影响,确定了提高Bacillus subtilis SK11.004合成γ-谷氨酰转肽酶有效策略;其次结合谷氨酸对细胞产酶的影响分析了γ-谷氨酰转肽酶在细胞中的作用,最后对利用γ-谷氨酰转肽酶催化合成γ-谷氨酰甲胺的有效途径进行证实,并分析了反应条件对合成的影响。因此本研究的主要内容包括以下几个方面:1.利用部分影响因子试验设计对培养基的成分进行分析,确定了酵母膏和胰蛋白胨为影响γ-谷氨酰转肽酶合成的显著因素,通过最陡爬坡法逼近响应最大区域,利用中心试验设计和响应面分析建立酵母膏和胰蛋白胨浓度对γ-谷氨酰转肽酶合成量的二次模型,最终得到Bacillus subtilis SK11.004合成γ-谷氨酰转肽酶的最优化培养基成分为（g/L）:葡萄糖15.0,胰蛋白胨15.1,酵母膏27.85,MgSO4·7 H2O 0.5,K2HPO4·3 H2O 1.0。在此情况下,最大产酶酶活为3.35U/mL。不同金属离子对γ-谷氨酰转肽酶合成的影响表明,Ca2+和Zn2+对GGT合成具有抑制作用,而Mn2+对GGT的合成具有促进作用,100μmol/L的Mn2+能够最大程度促进Bacillus subtilis SK11.004合成GGT。2.不控制发酵条件下,γ-谷氨酰转肽酶合成与细胞生长部分相关,细胞生长的对数期和稳定期都能进行酶的合成,在稳定期后期酶的合成量达到最大,葡萄糖的存在抑制酶的合成。3.培养温度对γ-谷氨酰转肽酶合成的影响分析表明,低温延长了细胞的延滞期和对数期,不能够刺激细胞γ-谷氨酰转肽酶合成;高温下会导致γ-谷氨酰转肽酶合成后快速降解,37℃为最适产酶温度。发酵过程pH控制对γ-谷氨酰转肽酶合成具有显著的影响,酸性环境能够刺激酶的合成,碱性环境抑制酶的合成,最适的产酶pH值为6.5。溶解氧的提高能够促进细胞的生长,但在稳定期,过高的溶氧会导致γ-谷氨酰转肽酶的稳定性降低;低溶氧条件有利于酶的合成却使得细胞生长处于氧限制状态。通过分析发酵控制下的细胞生长和产酶动力学,提出阶段溶氧（0-4 h,40%;4-6 h,30%;6-18 h,10%）并结合恒定pH（6.5）的联合控制策略,实验结果表明,细胞的比生长速率和酶的比合成速率都得到明显提高,γ-谷氨酰转肽酶合成量较未控制发酵条件下提高了13.69倍。4.谷氨酸的添加能够抑制γ-谷氨酰转肽酶的合成,而γ-谷氨酰转肽酶的抑制剂仅使胞外的谷氨酸浓度降低,结合胞外聚谷氨酸的链长随γ-谷氨酰转肽酶活性增加不断减少,推测γ-谷氨酰转肽酶在细胞中的作用为从末端水解聚谷氨酸,为细胞在稳定生长提供谷氨酸。5.利用高效液相色谱（HPLC）、质谱（MS）、红外光谱（IR）和核磁共振波谱（NMR）等分析手段对γ-谷氨酰转肽酶以L-谷氨酰胺和甲胺为底物催化的转肽反应产物进行分析和结构表征,证实通过γ-谷氨酰转肽酶合成γ-谷氨酰甲胺是有效的途径。对γ-谷氨酰甲胺合成反应中的影响因素分析表明,底物浓度、底物摩尔比和反应pH值为主要影响因素。利用中心设计试验方法,结合响应面分析,建立了γ-谷氨酰甲胺合成量与三者的二次显著性模型方程,通过方程得到γ-谷氨酰甲胺合成的最优条件为:反应时间为5h,反应温度为37℃,GGT酶活0.56 U/mL,底物L-谷氨酰胺浓度为0.34 mol/L,底物甲胺和L-谷氨酰胺摩尔比为5.23,反应pH值为10.6。在最优反应条件下,γ-谷氨酰甲胺的最大合成量为23.95g/L。
