提高PDMAEMA/DNA复合物基因转染效率和血清稳定性的研究

聚甲基丙烯酸-N,N’-二甲氨基乙酯论文 星形聚合物论文 磺基甜菜碱论文 血清稳定性论文 基因递送论
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本文运用原子转移自由基聚合技术一锅法合成了以聚N, N’-双(丙烯酰)胱胺(PBAC)为交联核,以线性聚甲基丙烯酸-N, N’-二甲氨基乙酯(l-PDMAEMA)为臂的星形阳离子聚合物s-PDMAEMA。在二硫代苏糖醇(DTT)还原条件下,s-PDMAEMA显示了可降解能力。s-PDMAEMA聚合物具有比l-PDMAEMA更强的压缩DNA能力。s-PDMAEMA具有优于其对应线性l-PDMAEMA的细胞转染效率,s-PDMAEMA200的转染效果高于PEI25kDa,且毒性更低。通过酸碱滴定实验考察了l-PDMAEMA、s-PDMAEMA载体的质子缓冲效应。采用AFM观察不同pH对l-PDMAEMA/DNA、s-PDMAEMA/DNA复合物形貌的影响。以时间相关荧光光谱技术考察了l-PDMAEMA/DNA、s-PDMAEMA/DNA的核酸降解酶稳定性。结果表明,交联结构聚合物分子内部渗透压提高,星形聚合物表现出了比线性聚合物更强的质子缓冲能力。当环境pH值从7.4降到5.0,l-PDMAEMA/DNA复合物变得更为紧密;相反,由于带正电的臂向外部伸展,s-PDMAEMA/DNA复合物呈现疏松形态。自由和结合溴化乙锭的相对含量变化证实s-PDMAEMA能够对DNA提供更有效的保护,s-PDMAEMA具有密集的叔胺基团,能够吸收更多质子,有利于复合物的高效内涵体逃逸。通过原子转移自由基聚合方法合成了DMAEMA与3-(甲基丙烯酰胺)丙基-二甲基(3-磺丙)胺(MPDSAH)的共聚物,并考察了这一聚合物作为新型基因载体的应用。MTT实验结果显示,引入磺酸类聚两性电解质PMPDSAH降低了PDMAEMA阳离子载体的细胞毒性。PDMAEMA200-PMPDSAH80共聚物具有高于PDMAEMA200均聚物载体的转基因效率。在复合比8/1 ,PDMAEMA200-PMPDSAH80载体的基因转运效果与PEI25kDa相当。体外细胞转染实验结果显示, PDMAEMA200-PMPDSAH80显示了明显高于同类物PDMAEMA200-PMPC80的转染效果。流式细胞实验表明高亲水性的PMPC嵌段削弱了PDMAEMA200/DNA纳米复合物的细胞内化效果;相反,引入PMPDSAH增加了PDMAEMA200/DNA复合物的细胞摄取能力。DSC测定结果揭示PDMAEMA200-PMPC80与PDMAEMA200对DPPC膜扰动能力相当,PDMAEMA200-PMPDASH80具有高于PDMAEMA200的DPPC膜扰动能力,推断PMPDSAH具有相对较强的细胞膜扰动能力,促进了复合物的细胞内吞。
摘要第3-4页
ABSTRACT第4-5页
第一章 前言第10-37页
    1.1 概述第10页
    1.2 非病毒基因载体第10-19页
        1.2.1 阳离子脂质体(Liposome)第10-14页
        1.2.2 聚乙烯亚胺(PEI)第14-15页
        1.2.3 树枝状聚合物载体(Dendrimers)第15-17页
        1.2.4 聚赖氨酸(PLL)第17-18页
        1.2.5 聚甲基丙烯酸-N, N’-二甲氨基乙酯(PDMAEMA)第18-19页
    1.3 聚阳离子载体介导的基因转运过程及面临屏障第19-24页
        1.3.1 复合物的形成第20页
        1.3.2 复合物的血液输送稳定性第20-21页
        1.3.3 复合物穿越血管内皮层及细胞外基质第21页
        1.3.4 复合物的细胞摄取第21-23页
        1.3.5 复合物的内涵体逃逸第23页
        1.3.6 复合物的细胞质转运第23-24页
        1.3.7 细胞核定位第24页
    1.4 提高聚阳离子载体基因转运效率的方法第24-35页
        1.4.1 提高复合物的血液输送稳定性第24-28页
        1.4.2 靶向细胞转染第28-30页
        1.4.3 提高复合物逃离内涵体/溶酶体效果第30-32页
        1.4.4 提高基因物质细胞质释放效果第32-34页
        1.4.5 提高DNA的细胞核运输效果第34-35页
    1.5 课题的提出及研究内容第35-37页
第二章 星型PDMAEMA聚合物作为基因载体的应用第37-55页
    2.1 引言第37页
    2.2 实验部分第37-44页
        2.2.1 原料与试剂第37-38页
        2.2.2 实验仪器第38-39页
        2.2.3 星型PDMAEMA聚合物的合成第39页
        2.2.4 傅立叶变换红外光谱检测第39页
        2.2.5 凝胶渗透色谱检测第39页
        2.2.6 二硫键含量的测定第39-40页
        2.2.7 降解实验第40页
        2.2.8 菌体的培养与质粒DNA的提取第40-41页
        2.2.9 聚合物/DNA复合物的制备第41页
        2.2.10 聚合物/DNA复合物形貌第41-42页
        2.2.11 琼脂糖凝胶电泳第42页
        2.2.12 毒性试验第42-43页
        2.2.13 细胞转染第43页
        2.2.14 荧光素酶活性测定第43页
        2.2.15 BCA法测总蛋白第43-44页
    2.3 结果与讨论第44-54页
        2.3.1 星型聚合物的合成及结构表征第44-46页
        2.3.2 聚合物的分子量及其分布第46-48页
        2.3.3 星型聚合物的二硫键含量测定第48页
        2.3.4 星型聚合物降解性能考察第48-49页
        2.3.5 琼脂糖凝胶电泳第49-50页
        2.3.6 聚合物/DNA复合物的尺寸及形貌第50-51页
        2.3.7 细胞转染第51-53页
        2.3.8 细胞毒性第53-54页
    2.4 本章小结第54-55页
第三章 星形PDMAEMA载体介导基因转染的机理研究第55-68页
    3.1 引言第55页
    3.2 实验部分第55-57页
        3.2.1 原料与试剂第55-56页
        3.2.2 实验仪器第56页
        3.2.3 滴定实验第56页
        3.2.4 聚合物/DNA复合物的制备第56页
        3.2.5 聚合物/DNA复合物的形貌第56页
        3.2.6 时间分辨荧光分析第56-57页
    3.3 结果与讨论第57-67页
        3.3.1 聚合物质子缓冲能力第57-59页
        3.3.2 聚合物/DNA复合物的形貌第59-63页
        3.3.3 时间分辨荧光研究第63-67页
    3.4 本章小结第67-68页
第四章 PDMAEMA-PMPDSAH共聚物作为基因载体的应用第68-82页
    4.1 引言第68-69页
    4.2 实验部分第69-72页
        4.2.1 原料与试剂第69页
        4.2.2 实验仪器第69-70页
        4.2.3 PDMAEMA-PMPDSAH嵌段共聚物的合成第70页
        4.2.4 聚合物的表征第70页
        4.2.5 质粒DNA的提取过程第70页
        4.2.6 聚合物/DNA复合物的制备第70-71页
        4.2.7 聚合物/DNA复合物形貌观察第71页
        4.2.8 琼脂糖凝胶电泳第71页
        4.2.9 Zeta电位和粒度测量第71页
        4.2.10 毒性试验第71-72页
        4.2.11 细胞转染第72页
        4.2.12 荧光素酶活性测定第72页
        4.2.13 BCA法测总蛋白含量第72页
    4.3 结果与讨论第72-81页
        4.3.1 PDMAEMA200-PMPDSAHx嵌段共聚物的合成及表征第72-75页
        4.3.2 凝胶电泳实验第75-76页
        4.3.3 聚合物/DNA复合物的形貌第76-77页
        4.3.4 复合物的zeta电位及粒度第77页
        4.3.5 细胞转染第77-80页
        4.3.6 毒性实验第80-81页
    4.4 本章小结第81-82页
第五章 PDMAEMA-PMPDSAH载体介导基因转染的机理研究第82-98页
    5.1 引言第82页
    5.2 实验部分第82-86页
        5.2.1 原料与试剂第82-83页
        5.2.2 实验仪器第83-84页
        5.2.3 PDMAEMA200-PMPC80嵌段共聚物的合成第84页
        5.2.4 聚合物的结构表征第84页
        5.2.5 质粒DNA的提取第84页
        5.2.6 聚合物/DNA复合物的制备第84页
        5.2.7 琼脂糖凝胶电泳第84-85页
        5.2.8 细胞转染第85页
        5.2.9 荧光素酶活性测定第85页
        5.2.10 BCA法测总蛋白含量第85页
        5.2.11 细胞内化效率测定第85页
        5.2.12 动态接触角测量第85-86页
        5.2.13 差示扫描量热分析第86页
    5.3 结果与讨论第86-97页
        5.3.1 PDMAEMA200-PMPC80嵌段共聚物的合成第86-88页
        5.3.2 凝胶电泳实验第88-89页
        5.3.3 细胞转染第89页
        5.3.4 聚合物/DNA复合物的细胞内化效果研究第89-94页
        5.3.5 动态接触角测量第94-95页
        5.3.6 聚合物与二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)的相互作用第95-97页
    5.4 本章小结第97-98页
第六章 全文结论第98-100页
参考文献第100-111页
发表论文和参加科研情况说明第111-112页
致谢第112页
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