研究背景：ZNF580基因是本课题组以致动脉粥样硬化因素—低密度脂蛋白诱导人脐静脉内皮细胞系ECV304,采用差异显示逆转录——PCR技术分析得到的一个新基因(Genbank注册号：AF184939)。其cDNA 748-1266位碱基序列构成一个完整的开放阅读框架,编码172个氨基酸组成的蛋白质。其氨基端5-88位氨基酸序列为脯氨酸富含域,羧基端94-172位氨基酸序列中含有三个串联重复的C2H2型锌指蛋白结构域。ZNF580蛋白的结构与Sp1/KLF锌指转录因子家族成员非常相似,Sp1/KLF家族成员的羧基端氨基酸序列中均含有三个高度保守的C2H2型锌指蛋白主构域,氨基端一般不具保守性。故ZNF580很可能是Sp1/KLF转录因子家族的一个新成员。最新的研究显示：Sp1/KLF家族成员可能是真核细胞转录机制的最重要参与者。具有调节细胞增殖分化、个体生长发育等诸多功能并可能参与多种疾病的发生、发展过程。Sp1/KLF家族成员调节基因转录的机制主要是其锌指结构可以作为DNA结合域(DNA binding domain, DBD),与靶基因富含G/C的顺式作用元件结合,识别靶基因调控区9个核苷酸组成的顺式作用元件。但越来越多的证据显示：锌指转录因子既可结合DNA,又可结合蛋白质。且在结合蛋白质方面,具有更加重要而广泛的作用。目的：寻找可能与锌指转录因子ZNF580存在相互作用的蛋白,并深入研究ZNF580的功能及其可能参与的信号转导通路,并最终揭示其与血管内皮损伤及动脉粥样硬化性疾病发生间的关系。方法：以ZNF580基因开放阅读框作为模版,PCR扩增后连接入酵母表达质粒pGB。诱饵质粒pGB-ZNF580经测序验证后转化酵母菌株Y190,人胎脑cDNA文库亦转化到能稳定表达诱饵蛋白的Y190酵母菌株中,并铺到含有营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-His/-Leu)的培养皿上进行初步筛选。所得阳性克隆再进行β-gal滤纸转移实验,进一步去除假阳性后共获得136个阳性克隆。随机挑取其中40个,逐一转化入含有诱饵质粒的Y190酵母菌进行一对一验证,最终确定其中的35个为阳性克隆,分离阳性克隆质粒并测序。最后应用生物信息学方法分析阳性克隆cDNA编码的蛋白。在14种蛋白中,我们重点选择SMAD2进行进一步的研究,因为SMAD2是哺乳动物细胞中转化生长因子-B(Transforming growth factor-β,TGF-β)信号转导通路的重要信号分子。我们在人胚肾293(human embryonic kidney, HEK293)细胞中用免疫共沉淀的方法验证了ZNF580和SMAD2的相互作用。又进一步在EA.hy926内皮细胞中应用免疫荧光共定位实验检测了两种蛋白在细胞中的定位。结果：确定了14种与ZNF580可能存在相互作用的蛋白。分别为：Activity-dependent neuroprotective protein (ADNP)、Smad family member 2 (SMAD2)、Glyoxalase domain containing 4 (GLOD4)、Kinesin family member 3A (KIF3A)、Kinesin-associated protein 3 (KIFAP3)、Phospholipase A2-activating protein (PLAA)、Phospholipase C gamma 1 (PLCGl)、XPA binding protein 2 (XAB2)、Tripartite motif-containing 32 (TRIM32)、Suppressor of Ty 16 homolog (SUPT16H)、Wilms tumor 1 interacting protein (WTIP)、DIP2 disco-interacting protein 2 homolog C (DIP2C)、SH3-domain GRB2-like 3 (SH3GL3)、D4, zinc and double PHD fingers family 1 (DPF1)。免疫共沉淀实验证实ZNF580和SMAD2在HEK293细胞中存在相互作用。免疫荧光共定位实验证实两种蛋白在EA.hy926内皮细胞中存在共定位现象,且定位主要集中于细胞核。结论：1.获得了14种与ZNF580可能存在相互作用的候选蛋白。2.免疫共沉淀及免疫荧光共定位实验证实ZNF580和SMAD2在哺乳动物细胞中存在相互作用,且此种相互作用主要发生在细胞核中。3.ZNF580是TGF-B信号转导通路的下游分子,其在细胞核中可以和SMAD2形成共作用因子,共同调节下游靶基因的转录。4.以上候选蛋白的获得及ZNF580和SMAD2相互作用的存在,为进一步研究转录因子ZNF580的功能及其参与动脉粥样硬化的机制奠定了实验基础。
