慢性髓性白血病（CML）是骨髓造血干细胞克隆性增殖形成的恶性肿瘤,占成人白血病的15%,全球年发病率为1.6-2.0/10万,而中国的几个地区流行病学调差显示CML的年发病率0.39-0.55/10万。中国CML患者较西方更为年轻化。CML细胞遗传学特征为Ph染色体,即t（9;22）（q34;q11）,并形成BCR-ABL融合基因,编码具有很强酪氨酸激酶活性的210kDa蛋白。α-ABL基因定位细胞核,编码酪氨酸激酶活性,由于染色体易位形BCR/ABL融合蛋白后,易位至胞浆,并出现酪氨酸激酶活性增高,伊马替尼作为BCR/ABL靶向抑制剂成为CML的一线治疗方案,尽管大多数患者对伊马替尼治疗有反应,但仍有一部分患者原发耐药,或出现疾病进展进入加速期、急变期,对于这部分患者酪氨酸激酶抑制剂效果差,患者生存期缩短,BCR/ABL基因拷贝明显升高,出现持续的酪氨酸激酶活性增高。SHP-1基因为含有SH2的酪氨酸磷酸酶（SH2-containing tyrosine phosphatase-1）,主要表达于造血细胞,在生长因子受介导的信号传导过程中具有重要的负性调控作用,是造血细胞恶性肿瘤的抑癌基因,Liedtke M等研究显示在32D/Bcr-Abl、3T3细胞株中通过免疫共沉淀发现SHP-1和BCR/ABL形成复合物,两者之间存在有相互作用,我们前期研究报道SHP-1在初治AML患者表达水平显著降低;同时通过DNA测序未发现在白血病细胞中有SHP-1的基因突变,并且在慢性髓系白血病慢性期SHP-1表达水平显著增高,而加速期和急变期SHP-1表达水平下调,并显示CML加速期及急变期患者SHP-1甲基化。与遗传突变不同的是,DNA甲基化是可逆的。在癌症细胞株中,使用DNA去甲基化试剂能够使得沉默的基因重新表达,地西他滨是当代研究最多的DNA甲基化转移酶抑制剂。2006年5月2日美国FDA正式批准地西他滨用于骨髓增生异常综合征（MDS）患者治疗,国外几项临床研究显示对于CML各期患者,地西他滨单药治疗有效,那么急变期、加速期及慢性期对伊马替尼原发耐药的患者,是否可以通过联合应用地西他滨是SHP-1基因去甲基化恢复SHP-1表达的水平,使BCR/ABL酪氨酸磷酸激酶活性下降,从而增强患者对伊马替尼的敏感性而增强治疗效果?因此,为了进一步探讨SHP-1基因甲基化在慢性髓性白血病发生中的作用以及DNA甲基化转移酶抑制剂地西他滨对进展期慢性髓性白血病的治疗作用,本实验从以下几个方面进行了研究:1.免疫共沉淀法验证SHP-1与P210BCR/ABL间的相互作用;2.地西他滨联合TKIs对K562细胞增殖及凋亡的影响;3.地西他滨对K562细胞株及CML患者SHP-1及BCR/ABL基因表达的影响;4.地西他滨对K562细胞SHP-1基因甲基化状态的影响。本文拟通过以上研究,深入分析SHP-1基因甲基化在CML发生发展中的作用,为CML进展期去甲基化治疗提供理论依据。第一部分:免疫共沉淀法验证SHP-1与P210BCR/ABL间的相互作用目的:利用免疫共沉淀法验证SHP-1蛋白和P210BCR/ABL间的相互作用。方法:K562细胞培养及淋巴细胞分离液提取慢性髓性白血病患者单个核细胞,抗c-ABL抗体沉淀SHP-1相互作用蛋白复合物后,用抗SHP-1抗体进行Western blot检测。结果:1在K562细胞及慢性髓性白血病各期患者细胞,利用免疫共沉淀技术均可以检测到SHP-1的表达;2在K562细胞株及CML-BP患者SHP-1表达水平较CML慢性期患者明显下降。在K562细胞株SHP-1表达水平较CML慢性期患者明显下降（P<0.05）,CML-BP患者SHP-1表达水平较CML慢性期患者明显下降（P<0.05）。结论:利用免疫共沉淀技术证实在K562细胞及慢性髓性白血病患者细胞SHP-1与P210BCR/ABL之间存在着相互作用。在K562细胞株及CML-BP患者SHP-1表达水平较CML慢性期患者明显下降,表明SHP-1基因失活参与了慢性髓性白血病疾病进展过程。第二部分:地西他滨联合TKIs对K562细胞增殖及凋亡的影响目的:研究DAC对K562细胞株的增埴抑制作用及DAC联合TKI的对K562细胞株的增埴抑制作用。方法:1 K562细胞培养;2 CCK8法测定不同药物浓度处理K562细胞株48小时候的OD值,计算出伊马替尼EC50值227.5nmol,尼罗替尼EC50值10.55nmol,地西他滨EC50值6457nmol。3分组:空白对照组、5μmol DAC单药组;0.1μmol IM单药组、0.01μmol尼罗替尼单药组、0.1μmolIM联合5μmol DAC、0.01μmol尼罗替尼联合5μmolDAC处理K562细胞株。4流式细胞术（FCM）检测药物处理K562细胞株48小时候早期凋亡率;结果:1单药作用或联合用药对K562细胞的抑制率1.1 DAC对K562细胞的增殖抑制作用呈浓度时间依赖性（r=0.9999,P<0.001）,72h抑制率达高峰。1.2 5μmolDAC联合0.1μmol IM在48小时细胞抑制率大于0.1μmol IM单药治疗组,P<0.0001,差异有统计学意义。1.3 5μmolDAC联合0.01μmol尼罗替尼在48小时细胞抑制率大于0.01μmol尼罗替尼单药治疗组,P=0.0015,差异有统计学意义。2单药作用或联合用药对K562细胞凋亡的影响2.1 5μmolDAC单药组处理K562细胞48h后早期凋亡率3.3%。2.2 0.1μmol IM作用48h后,凋亡细胞占6.7%,5μmolDAC联合0.1μmol IM作用48h后凋亡细胞占28.7%。P<0.05,差异有统计学意义。2.3 0.01μmol尼罗替尼单药治疗组作用48h后,凋亡细胞占9.3%,5μmolDAC联合0.01μmol尼罗替尼作用48h后凋亡细胞占35.7%。P<0.05,差异有统计学意义。结论:1 DAC对K562细胞有增殖抑制作用且呈浓度时间依赖性（r=0.9999,P<0.001）;2伊马替尼联合地西他滨组与伊马替尼单药组相比细胞抑制率明显升高,两者有显著性差异,根据Soriano等的判断方法,计算了两药联合作用指数0.41为高度协同作用,0.01umol尼罗替尼分别与5umol地西他滨联合处理K562细胞株48小时后细胞抑制率与单药组相比有显著性差异,P<0.05.计算了两药联合作用指数0.33为强协同作用。3 TKI联合DAC与TKI单药治疗组相比,K562细胞凋亡率增加。第三部分:地西他滨对K562细胞株及CML患者SHP-1及BCR/ABL基因表达的影响目的:本研究探讨地西他滨对慢性髓性白血病抑癌基因SHP-1表达的影响。方法:分为空白对照组,0.1umol IM单药治疗组、5umolDAC单药治疗组、以及0.1umol IM联合5umol DAC组处理K562细胞株及慢性髓性白血病患者各期原代细胞后。RQ-PCR测定各组SHP-1及BCR/ABL基因表达水平;免疫共沉淀测定各组SHP-1蛋白水平的表达;结果:1药物处理K562细胞株后SHP-1及BCR/ABL表达水平。1.1伊马替尼和尼罗替尼单药处理组和空白组相比对SHP-1基因表达水平没有显著性差异。1.2地西他滨组与空白组相比SHP-1基因表达水平升高,有显著性差异。1.3伊马替尼联合地西他滨与伊马替尼单药组相比,SHP-1表水平升高,有显著性差异,尼罗替尼联合地西他滨与尼罗替尼单药相比,SHP-1表水平升高,有显著性差异。1.4伊马替尼联合地西他滨与伊马替尼单药组相比,BCR/ABL与ABL拷贝数比值水平下降,有显著性差异,尼罗替尼联合地西他滨与尼罗替尼单药相比,BCR/ABL与ABL拷贝数比值水平下降,有显著性差异。1.5伊马替尼联合地西他滨与伊马替尼单药组相比,SHP-1蛋白表达灰度值增高,两者比较有显著性差异。1.6尼罗替尼联合地西他滨组与尼罗替尼单药组相比,SHP-1蛋白表达灰度值增高,两者比较有显著性差异。2体外药物处理慢性髓性白血病原代细胞后SHP-1及BCR/ABL表达水平。2.1伊马替尼组和空白组相比对SHP-1基因表达水平没有显著性差异。2.2地西他滨组与空白组相比SHP-1基因表达水平升高,有显著性差异。2.3伊马替尼联合地西他滨与伊马替尼单药组相比,SHP-1表水平升高,有显著性差异。2.4伊马替尼联合地西他滨与伊马替尼单药组相比,SHP-1蛋白表达灰度值增高,两者比较有显著性差异。结论:1伊马替尼对SHP-1基因表达无影响。2地西他滨能够使沉默SHP-1基因重新表达。3伊马替尼联合地西他滨处理K562细胞株相对伊马替尼单药处理组SHP-1mRNA及蛋白水平升高,BCR/ABL mRNA及蛋白水平均下降。第四部分:地西他滨对K562细胞SHP-1基因甲基化状态的影响目的:研究SHP-1基因甲基化状态在慢性髓性白血病（cML）疾病进展中的作用及其机制。方法:本研究采用MSP法对空白对照组,IM组、DAC组、IM+DAC组分别处理K562细胞株测定SHP-1基因的甲基化状态。结果:1 K562细胞株可测的SHP-1基因甲基化;2 IM处理组对K562细胞株SHP-1基因甲基化状态无影响;3 DAC处理组未测到SHP-1基因甲基化状态。4 IM+DAC组无SHP-1基因甲基化。结论:1 SHP-1甲基化导致SHP-1基因失活。2地西他滨可通过去甲基化作用使沉默的SHP-1基因重新表达。3伊马替尼对SHP-1甲基化状态无影响。4地西他滨、伊马替尼通过不同靶标治疗进展期慢性髓性白血病。结论:1在CML患者与K562细胞中SHP-1与P210BCR/ABL蛋白形成复合物,两者之间存在一定相互作用。SHP-1可能为控制P210BCR/ABL酪氨酸激酶活性的一种酪氨酸磷酸酶。2在K562细胞株及CML-BP患者SHP-1表达水平较CML慢性期患者明显下降,表明SHP-1基因失活参与了慢性髓性白血病疾病进展过程。3 K562细胞株可测的SHP-1基因甲基化,SHP-1甲基化导致SHP-1基因失活。4地西他滨可通过去甲基化作用使沉默的SHP-1基因重新表达。5伊马替尼联合地西他滨组与伊马替尼单药组相比细胞抑制率明显升高,两者有显著性差异。6地西他滨、伊马替尼通过不同靶标治疗进展期慢性髓性白血病。为治疗进展期慢性髓性白血病提高一种新的治疗策略。
