目的:根据天然食道肌层内环外纵的双层结构,制备出一种具有双面微槽构造的生物降解性的聚氨酯(PU)支架,作为食道肌层损伤修复的替代物,引导食道外纵肌和内环肌的再生,并在动物体内进行肌层的在体培育,为食道疾病的治疗提供了基础的实验依据。方法:通过组织块贴壁的方法,从新西兰大白兔食道中提取并培养原代平滑肌细胞(SMCs),作为实验用种子细胞。同时,课题组自制了带有两种微槽构造的硅材质模具,微槽构造分别为:具有连续凹槽的图案(P1),槽宽200 um,槽深30 um,槽间距30 um;和具有不连续凹槽图案(P2),槽宽100 um,槽深30 um,间隔30 um,间隔前后间距30 um,间隔长150 um,以无图案的PU支架(P3)作为对照。将医用的生物可降解的PU材料溶于1,4-二氧六环溶液中,得到PU溶液,倒在用上述自制模具制备的子模具(PDMS)上,制备了两种上述P1和P2图案的支架PU1和PU2。通过对制备的PU支架进行丝素蛋白(SF)的接枝得到PU1-SF和PU2-SF,提高其表面的亲水性能,进一步提高其生物相容性。将上述原代SMCs种植于改性前后的支架上,检测SMC在其上的生长特性,利用四甲基偶氮唑盐(MTT)检测细胞在支架上生长率,利用细胞免疫荧光实验和扫描电镜(SEM)检测支架表面细胞的生长形态及鉴定细胞类型,利用蛋白印迹实验检测支架上平滑肌细胞的表达肌动蛋白的能力,通过上述几种方法来探索制备的PU支架对SMCs具有良好的细胞相容性和细胞生长的方向性诱导作用,细胞在PU2-SF上的生长率优于PU1-SF,并且更能保持平滑肌的形态。为了在实验动物体内诱导再生组织中血管的生长,根据前期实验结果采用对上述改性后支架接枝血管内皮生长因子(VEGF)的方法。另外,为缓解支架成管后内面的机械张力,将点断的PU2作为管子内层,而连续PU1作为管子外层,用1,4-二氧六环将二层支架以微槽垂直取向黏合成具有双面微槽的复合支架。建立动物食管肌层缺损模型,将制备的支架植入损伤处,进行体内原位替代实验,包括片状支架替代和环状支架整环替代,以观察并培养食道外纵肌和内环肌的生长,H&E染色检测支架对损伤面的修复和再生作用。结果:在体外通过组织块贴壁法成功获取了原代平滑肌细胞,传至多代后仍能保持良好的平滑肌形态,实验用到的细胞为2~4代。制备了两种微槽构造的复合支架,通过对细胞-支架的体外复合培养及检测,证明丝素蛋白改性后能促进支架上细胞的生长,细胞也能沿着支架纹路的方向取向,这对平滑肌细胞维持其生物功能非常重要。体内原位替代结果显示,制备的支架可以引导食道肌层的生长,包括纵肌和环肌,对损伤的肌肉组织具有修复和再生作用。结论:制备的双面纹路支架可以引导平滑肌细胞的生长和分化,体内可以作为食道肌层修复和再生的替代物。
