重组家蚕丝素重链蛋白的构建与表达

蚕丝作为一种天然的动物蛋白质，越来越多地被研究用作生物材料，尤其是组织工程支架。丝素蛋白生物材料的应用主要是作为组织修复用材料，而修复不同的组织，对于材料的结构和性能也有不同的要求，材料的结构性能由蛋白质的二级结构所决定，二级结构取决于蛋白质氨基酸的组成及其排列顺序。组成家蚕丝素蛋白主要有重链，轻链和P25蛋白，每段序列的存在对丝素蛋白的结构性能都有特定的意义，也是我们必须要弄清楚的科学问题。作为丝素主要组成部分的重链，由结晶和非结晶区交错排列组成，结构有序、规整，有利于合理设计。本文对丝素重链进行分析设计，为了更好地研究蛋白质序列-结构-功能间的关系，我们采用基因工程技术将家蚕丝素重链结晶区非结晶区的基因序列重组克隆，采用微生物大肠杆菌表达系统大量表达制备蛋白、分离纯化，并初步对表达产物进行了定性定量分析，为研究家蚕丝素重链各个序列对丝素结构与功能(尤其生物学功能)的影响提供材料及制备方法。分析家蚕丝素蛋白重链的基因序列及编码的氨基酸序列，结合本课题之前的设计研究，本文将设计的几种典型的结晶区重复肽段(GAGAGX)16(X=A,S,V,Y)与非结晶区肽段(F)进行基因重组，将结晶区重复肽段(GAGAGS)16与不同倍数非结晶区(Fn)进行基因重组，并构建了重组基因的pGEX系列表达载体。采用PCR方法克隆了家蚕丝素重链的C-末端多肽序列的编码基因，构建了克隆质粒，为以后进一步与丝素重链核心区重组奠定基础。通过琼脂糖凝胶电泳和DNA测序鉴定了所有克隆质粒和表达载体构建的正确性，没有发生任何基因突变和缺失。将构建的表达载体转染大肠杆菌BL21中加入IPTG诱导表达。经过SDS-PAGE电泳和Western blot技术分析表明表达载体pGEX能很好地表达目的蛋白。本文重点研究了丝素重链结晶区(GAGAGS)16肽段与不同倍数非结晶区肽段的重组基因的优化表达条件，主要包括表达载体pGEX-gs16f1、pGEX-gs16f4、pGEX-gs16f8和pGEX-gs16f12，其相对应的表达产物为谷胱甘肽巯基转移酶(GST)标签的融合蛋白GST-GS16F1、GST-GS16F4、GST-GS16F8和GST-GS16F12。调查了诱导剂异丙基-β-D硫代半乳苷糖(IPTG)不同浓度(0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0mmol/L)和不同诱导培养时间(0，1，2，3，4，5，6，7，8h)对GST-GS16F1、GST-GS16F4、GST-GS16F8和GST-GS16F12表达的影响，结果表明四种融合蛋白最佳表达的诱导剂浓度分别为0.2mmol/L、0.1mmol/L、0.4mmol/L和0.6mmol/L；诱导培养时间分别为3小时、4小时、6小时和3小时。大量表达了三种融合蛋白GST-GS16F1，GST-GS16F4和GST-GS16F8，采用GST亲和层析柱分离纯化，SDS-PAGE结果显示均获得了纯度较高的单一蛋白。利用紫外分光光度计测得三种融合蛋白在最佳IPTG浓度和培养时间下的表达产率分别为每升菌液菌细胞表达53.20、30.59和14.02mg左右。纯化并超滤后的融合蛋白GST-GS16F1，GST-GS16F4和GST-GS16F8采用凝血酶酶切后分离得到目的肽段GS16F1，GS16F4和GS16F8。对融合蛋白和目的肽段进行了质谱分析，测量结果得到的分子量与理论值相一致。对纯化并超滤的三种融合蛋白GST-GS16F1，GST-GS16F4和GST-GS16F8进行了等电点性质的测定和氨基酸组成分析。Zeta-电位分析显示融合蛋白GST-GS16F4和GST-GS16F8的等电点在4~4.5之间，GST-GS16F1的等电点在5~5.5之间，与理论值相一致。氨基酸组成的实际测量值与理论值也相符。这些结果间接说明了设计的重组蛋白得到了正确的表达。