K562/ADM细胞耐药性与有氧糖酵解的关系及双氢青蒿素诱导其铁死亡的研究

有氧糖酵解论文 多药耐药论文 糖酵解抑制剂论文 AKT/mTOR论文 Mek/MAPK论文 K562
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有氧糖酵解与K562/ADM细胞耐药性的关系研究背景与目的:多药耐药性(Multi-drug resistance,MDR)的产生是导致肿瘤化疗失败的主要原因之一。有氧糖酵解增强已被列为肿瘤细胞重要的生物学标志。近年研究认为增强的有氧糖酵解与肿瘤恶性程度及临床耐药密切相关,但其发生机制及调控方式并不清楚。本课题以白血病敏感细胞K562和由K562诱导而来的MDR细胞K562/ADM为研究模型,比较研究药物敏感细胞与耐药细胞糖代谢模式的差异,明确耐药细胞不同于亲本敏感细胞的糖代谢特征,探讨K562/ADM细胞多药耐药性与有氧糖酵解的关系,深入分析抑制有氧糖酵解逆转K562/ADM细胞耐药性的可行性及分子机制,以期为临床克服肿瘤细胞耐药提供新的策略。方法:采用MTT法检测细胞的增殖活性;酶学方法检测细胞葡萄糖消耗、乳酸产量、糖代谢相关酶活性及谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量;生物发光法检测三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP),荧光探针标记法检测细胞内线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential,MMP)和活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平;Western-blotting法检测糖代谢相关信号通路中蛋白的表达及活化程度。结果:1.常氧条件下,K562/ADM细胞葡萄糖消耗量和乳酸生成量均明显高于亲本K562细胞(P<0.05),但ATP含量无显著性的差异;酶活性相比于K562细胞,K562/ADM细胞己糖激酶(hexokinase,HK)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)和丙酮酸激酶(pyruvate,PK)的酶活性显著增高(P<0.05-0.001)、磷酸果糖激酶(phosphofructokinase,PFK)活性降低(P<0.01);Western-blotting检测发现K562/ADM细胞葡萄糖转运体4(glucose transporter 4,GLUT4)和LDH-A表达量高于K562细胞(P<0.01-0.001)。比较线粒体功能变化,K562/ADM细胞MMP低于K562细胞,GSH水平升高(P<0.01-0.001),但ROS水平两细胞无显著差异。2.糖酵解抑制剂2-脱氧葡萄糖(2-deoxyglucose,2-DG)的干预会增强K562/ADM细胞和K562细胞对阿霉素(adriamycin,ADM)的敏感性,K562细胞增殖抑制率提高了15%,而K562/ADM细胞则提高达30%。2-DG能够降低细胞ATP含量,当2-DG浓度达到4m M时,K562/ADM细胞ATP下降倍数高于K562细胞近1倍。ADM可使白血病细胞内葡萄糖消耗、乳酸输出及己糖激酶活性均受到抑制,联合应用2-DG抑制糖酵解后,K562细胞葡萄糖消耗量的抑制率增加30%,乳酸生成的抑制率增加10%,而K562/ADM细胞则分别达到40%、30%;抑制糖代谢对K562细胞HK活性几乎没有影响,而K562/ADM细胞HK活性则下降了10个单位。此外,2-DG还诱导K562/ADM细胞内ROS含量上升和GSH浓度的降低。3.K562/ADM细胞与K562细胞比较,AKT-m TOR-c Myc和Mek-MAPK信号通路处于高活化状态。糖代谢抑制剂2-DG能够显著抑制K562/ADM细胞AKT-m TOR-c Myc和Mek-MAPK信号通路,2-DG与ADM联合处理,K562/ADM细胞AKT表达量明显下降,而K562细胞没有明显变化;K562/ADM细胞m TOR表达及磷酸化水平降低70%以上,而K562细胞下降则不足30%;K562/ADM细胞c-Myc表达下降14%,K562细胞没有变化;K562/ADM细胞Mek、MAPK表达量及磷酸化水平下降均超过40%,K562细胞几乎不受影响。2-DG抑制K562/ADM细胞糖代谢相关AKT-m TOR-c Myc通路,其下游糖代谢相关蛋白GLUT4、LDH-A、GSK-3β的表达均受到抑制(P<0.05-0.01)。结论:1.K562/ADM耐药细胞有氧糖酵解能力显著强于K562敏感细胞,存在HK、PK、LDH活性增高,GLUT4、LDH-A高表达及线粒体供能减弱的代谢重编程现象。2.K562/ADM细胞的耐药性与增强的有氧糖酵解能力密切相关,抑制有氧糖酵解可有效逆转K562/ADM细胞对阿霉素的耐受性。3.2-脱氧葡萄糖逆转K562/ADM细胞耐药性的机制除直接竞争性抑制HK活性、降低糖酵解而减少ATP供应外,还与降低AKT-m TOR-c-Myc通路和Mek-MAPK通路活性、下调代谢效应蛋白GLUT4、LDH-A和GSK-3β表达量,进而降低耐药细胞能量代谢有关。双氢青蒿素诱导白血病K562/ADM耐药细胞铁死亡背景与目的:铁死亡(Ferroptosis)是近年发现的铁依赖性非凋亡细胞死亡方式,其形态学特征、生化特征、遗传特征等均与细胞凋亡、自噬性死亡和坏死等细胞死亡方式不同。近年的研究发现铁死亡与细胞自噬、线粒体功能障碍、氧化应激及细胞能量代谢密切相关。双氢青蒿素(Dihydroartemisinin,DHA)是青蒿素的一种衍生物,在肿瘤领域的研究成为近年来的热点。DHA抗肿瘤的机制包括促进凋亡、阻滞周期、抑制新生血管生成和依赖于铁离子的死亡。DHA依赖于铁离子的细胞毒性作用与铁死亡具有相关性。本研究以白血病多药耐药株K562/ADM细胞为模型,研究DHA能否诱发耐药性白血病细胞铁死亡。方法:MTT比色检测细胞增殖活性;Wright-Gimsa染色和电镜超微结构技术观察细胞铁死亡形态学的改变;酶学法检测细胞内谷胱甘肽含量;荧光探针标记检测细胞内活性氧水平;Western-blotting检测铁死亡相关蛋白GST和转铁蛋白受体(Tf R)的表达。观察铁死亡促进剂枸橼酸铁铵(FAC)和铁死亡抑制剂Ferrostatin-1对DHA诱导细胞死亡的影响。结果:1.不同浓度的DHA对白血病敏感细胞K562及耐药细胞K562/ADM均具有毒性效应。K562细胞12h、24h、48h的IC50值为50.22±2.48、31.89±1.66、7.43±0.09μmol/L,而K562/ADM细胞的IC50值则为71.18±3.19、40.54±1.75、20.01±1.37μmol/L,K562/ADM细胞对DHA的敏感性低于K562敏感细胞,具有一定的耐受性。2.Wright-Gimsa染色和电镜超微结构分析显示,DHA作用后,K562/ADM和K562细胞的形态均出现聚集、变形、肿胀,细胞膜起泡等改变。超微结构示细胞线粒体皱缩变小、线粒体膜浓缩致密、线粒体嵴减少或消失;细胞核正常且无染色质浓集改变。DHA显著降低K562及K562/ADM细胞GSH含量和提高细胞活性氧含量。提示经DHA诱导后K562/ADM细胞和K562细胞均表现出典型的铁死亡改变。3.铁死亡促进剂枸橼酸铁铵(FAC)显著增强DHA的细胞毒性及诱发的铁死亡效应,对K562/ADM细胞的作用更为明显,细胞线粒体浓缩、膜致密、嵴消失,GSH含量降低和ROS水平增高等改变更为显著。特异性铁死亡抑制剂Ferrostatin-1可部分逆转DHA诱导的白血病细胞增殖抑制和铁死亡现象,细胞GSH含量回升而ROS水平下降。进一步说明DHA抑制白血病耐药细胞增殖的机制为诱导细胞铁死亡。4.DHA作用后,K562/ADM细胞和K562细胞中GST和Tf R的表达均显著降低。枸橼酸铁铵促进DHA诱发的GST和Tf R蛋白表达水平的下降,而Ferrostatin-1则可部分逆转DHA的作用。结论:1.双氢青蒿素能够抑制K562/ADM耐药细胞和K562敏感细胞的增殖,K562/ADM细胞的敏感性低于K562细胞。2.双氢青蒿素诱导K562/ADM细胞和K562细胞发生铁死亡特征性改变。DHA诱发的铁死亡可被铁死亡诱导剂增强,或被铁死亡抑制剂所抑制。3.铁死亡是双氢青蒿素诱导白血病细胞死亡的主要机制之一。
中文摘要第3-7页
ABSTRACTs第7-11页
第一篇 有氧糖酵解与K562/ADM细胞耐药性的关系研究第16-73页
    第一章 前言第16-25页
        1 肿瘤细胞的多药耐药特性第16-18页
            1.1 肿瘤耐药性第16页
            1.2 肿瘤多药耐药性第16-17页
            1.3 肿瘤多药耐药的机制第17-18页
        2 肿瘤细胞的糖代谢第18-22页
            2.1 细胞葡萄糖代谢第18-20页
            2.2 肿瘤细胞有氧糖酵解第20-21页
            2.3 磷酸戊糖途径与肿瘤第21-22页
        3 有氧糖酵解与肿瘤耐药第22-25页
            3.1 有氧糖酵解增强促进肿瘤耐药第22-23页
            3.2 多药耐药和糖代谢相关信号通路第23-25页
    第二章 材料与方法第25-36页
        1 仪器与试剂第25-28页
            1.1 主要仪器第25-26页
            1.2 主要试剂第26-28页
        2 实验方法第28-36页
            2.1 细胞培养第28页
            2.2 MTT法检测药物敏感性第28页
            2.3 ATP含量的检测第28-29页
            2.4 糖代谢流量的检测第29-30页
            2.5 糖酵解关键酶活性的检测第30-32页
            2.6 线粒体膜电位的检测第32-33页
            2.7 总GSH含量的检测第33页
            2.8 ROS含量的检测第33页
            2.9 WesternBlot检测相关蛋白表达水平第33-35页
            2.10 统计学处理第35-36页
    第三章 实验结果第36-59页
        1 白血病K562和K562/ADM细胞的能量代谢状况第36-42页
            1.1 K562/ADM细胞的耐药性第36-37页
            1.2 K562/ADM细胞的糖代谢重编程第37-40页
            1.3 K562及K562/ADM细胞线粒体膜电位及ROS的比较第40-42页
            1.4 K562及K562/ADM细胞GSH的比较第42页
        2 抑制糖酵解增强K562/ADM细胞对阿霉素的敏感性第42-51页
            2.1 2 -DG对白血病细胞增殖的影响第42-44页
            2.2 2 -DG抑制K562/ADM有氧糖酵解功能第44-46页
            2.3 2 -DG增强白血病细胞对ADM的敏感性第46-47页
            2.4 抑制糖酵解促进K562/ADM细胞氧化应激第47-49页
            2.5 K562及K562/ADM细胞谷胱甘肽含量的变化第49-51页
        3 有氧糖酵解增强介导K562/ADM细胞耐药的分子机制第51-59页
            3.1 2 -DG抑制AKT-mTOR-cMyc信号途径第51-53页
            3.2 2 -DG抑制MAPK-Mek信号途径第53-55页
            3.3 AKT-mTOR信号通路下游糖代谢相关蛋白表达水平的改变第55-59页
    第四章 讨论第59-64页
    结论第64-65页
    参考文献第65-73页
第二篇 双氢青蒿素诱导白血病K562/ADM耐药细胞铁死亡第73-111页
    第一章 前言第73-79页
        1 铁死亡的提出第73页
        2 铁死亡的特征第73-74页
        3 铁死亡的机制第74-75页
        4 铁死亡与细胞代谢第75-76页
        5 青蒿素及其衍生物第76页
        6 双氢青蒿素的抗肿瘤作用第76-79页
    第二章 材料与方法第79-82页
        1 仪器与试剂第79页
            1.1 主要仪器第79页
            1.2 主要试剂第79页
        2 实验方法第79-82页
            2.1 细胞培养第79-80页
            2.2 MTT法检测细胞增殖活性第80页
            2.3 Wright-Gimsa法观察细胞形态第80页
            2.4 透射电子显微镜观察细胞内线粒体第80页
            2.5 总GSH含量的检测第80页
            2.6 ROS含量的检测第80页
            2.7 WesternBlot检测相关蛋白表达水平第80页
            2.8 统计学处理第80-82页
    第三章 实验结果第82-100页
        1 双氢青蒿素诱导K562/ADM细胞铁死亡第82-86页
            1.1 双氢青蒿素对白血病细胞的增殖抑制作用第82-83页
            1.2 双氢青蒿素诱导后白血病细胞形态学和线粒体的改变第83-84页
            1.3 双氢青蒿素降低细胞内GSH水平第84-85页
            1.4 双氢青蒿素促进细胞内ROS积聚第85-86页
        2 抑制铁死亡逆转DHA对耐药白血病细胞的作用第86-92页
            2.1 Ferrostatin-1部分逆转DHA对白血病细胞的增殖抑制效应..第86-90页
            2.2 Ferrostatin-1逆转DHA诱导的细胞形态学改变第90页
            2.3 Ferrostatin-1逆转DHA诱导的细胞内GSH水平降低第90-91页
            2.4 Ferrostatin-1减少DHA诱导的细胞内ROS积聚第91-92页
        3 促进铁死亡增强DHA对耐药白血病细胞的作用第92-97页
            3.1 枸橼酸铁铵增强DHA对白血病细胞的增殖抑制作用第92-95页
            3.2 枸橼酸铁铵增强DHA诱导的细胞线粒体损伤第95页
            3.3 枸橼酸铁铵促进DHA诱导的细胞内GSH水平的降低第95-96页
            3.4 枸橼酸铁铵增强DHA诱导的细胞内ROS堆积第96-97页
        4 双氢青蒿素抑制铁死亡相关蛋白的表达第97-100页
    第四章 讨论第100-103页
    结论第103-104页
    参考文献第104-111页
缩略词表第111-114页
攻读学位期间完成的科研成果第114-115页
致谢第115页
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