铅是自然界中广泛存在的一种重金属污染物。大量研究证实铅暴露对中枢神经系统具有显著的毒性作用,铅暴露可以导致发育期高级神经功能的损害,如认知障碍、注意力分散和行为异常等;而近年来研究发现铅暴露与包括阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)在内的多种神经退行性疾病的发生同样关系密切。铅神经毒性的机制目前尚未完全揭示,已有的研究发现铅暴露可以影响神经细胞即刻早期基因的表达、干扰神经递质及其受体的表达和功能、损害神经突触可塑性、诱导神经胶质细胞异常活化、破坏大脑屏障的结构和功能、扰乱脑内微量元素代谢等,提示铅暴露诱导神经毒性的机制可能是涉及影响神经细胞基因表达及脑内微环境的复杂的过程。铜是人体必需的微量元素,大脑铜含量在体内仅次于肝脏,适宜的铜水平对于大脑的发育及正常脑功能的维持的十分重要。但是另一方面,游离态铜离子具有强氧化性,过高的铜离子水平可破坏脑内环境的氧化-还原平衡,与某些神经退行性疾病可能存在病因学上的密切关联。细胞铜代谢是通过各种铜转运体和伴侣分子的相互作用而实现的,铜离子主要通过copper transporter 1(CTR1)进入细胞内,然后通过分子伴侣(如COX17、ATOX1等)转运到线粒体等细胞器;胞内铜离子的排出主要通过位于高尔基网络中的ATP7A或ATP7B转运。有研究发现铜离子代谢结构域包含体1(Copper Metabolism MURR1 Domain-containing 1,COMMD1)可以通过影响ATP7A和ATP7B的表达而参与调控细胞铜离子代谢,而X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)对于COMMD1蛋白的降解起到重要的调控作用。我们以往的研究发现:铅暴露可以通过影响CTR1、ATP7A等铜转运蛋白的表达而导致细胞内铜蓄积,提示铅可能通过扰乱脑内环境铜代谢而造成氧化应激损伤。但是,XIAP介导的COMMD1降解是否参与铅暴露影响脑内铜代谢的过程?其分子调控机制是什么?目前尚无相关报道。大脑屏障主要包括血脑屏障(Blood brain barrier,BBB)和血脑脊液屏障(bloodcerebrospinal fluid barrier,BCB),二者是维持脑内环境物质的平衡的重要结构。本研究通过建立体外BBB和BCB细胞模型,研究铅对大脑屏障细胞铜离子转运的影响,探讨XIAP调控的COMMD1降解在铅暴露所致大脑屏障铜代谢紊乱中的作用及其机制,为明确铅暴露扰乱脑内环境铜离子平衡的关键环节、阐明其分子调控机制提供研究基础。目的:本课题以大鼠脑微血管内皮细胞株RBE4和大鼠脉络丛上皮细胞株Z310为实验对象,分别建立铅暴露BBB和BCB体外模型,研究铅对细胞铜代谢的影响,明确XIAP调控的COMMD1降解是否参与铅暴露影响ATP7B和ATP7A等铜转运蛋白水平、诱导胞内铜蓄积的过程,并探讨其上下游的分子调控机制。方法:1.RBE4和Z310细胞体外培养,分别建立铅暴露BBB和BCB模型,采用MTT法筛选合适的铅暴露剂量。2.原子吸收分光光度法(AAS)检测细胞内铜水平。3.RT-PCR法检测铅暴露后细胞内XIAP、COMMD1、ATP7B和ATP7A的m RNA表达水平;Western blot法检测铅暴露后细胞XIAP、COMMD1、ATP7B和ATP7A蛋白表达水平。4.si RNA干涉技术抑制COMMD1表达,观察ATP7A、ATP7B表达水平及细胞铜吸收量的变化。5.构建质粒高表达XIAP,观察COMMD1、ATP7A、ATP7B表达水平及细胞铜吸收量的变化。6.分别设计含有野生型和E3泛素连接酶位点突变型XIAP片段的质粒,转染细胞,观察COMMD1表达变化,明确其对COMMD1表达调控的功能靶点。结果:1.铅暴露对RBE4和Z310细胞铜水平的影响RBE4和Z310细胞分别以含有2.5,5,10μmol/L醋酸铅的培养液培养24h后,置于37°C孵箱中以5μmol/L Cu Cl2孵育2h,AAS检测结果显示:与对照组相比,铅暴露后两种细胞内铜水平均显著增高(p<0.05),并呈剂量-效应关系。2.铅暴露对RBE4和Z310细胞XIAP、COMMD1、ATP7B和ATP7A的m RNA和蛋白表达水平的影响Western blot法结果显示:2.5,5,10μmol/L醋酸铅暴露24h后,或10μmol/L醋酸铅暴露24h和48h后,与对照组相比,两种细胞内XIAP、ATP7B和ATP7A蛋白水平均显著降低,COMMD1蛋白水平显著增高(p<0.01),呈剂量-和时间-效应关系。而与对照组相比,两种细胞内XIAP、COMMD1、ATP7B和ATP7A的m RNA水平均无显著改变。3.抑制COMMD1的表达对ATP7B的影响采用si RNA干涉COMMD1表达后,与scramble si RNA对照组相比,COMMD1si RNA干涉组细胞在铅处理后ATP7B蛋白水平降低幅度显著缩小(p<0.05),而ATP7A蛋白水平无显著改变(p>0.05)。4.干涉COMMD1的表达对RBE4和Z310细胞铜水平的影响使用si RNA干涉COMMD1表达,与scramble si RNA对照组相比,COMMD1si RNA干涉组细胞在铅处理后胞内铜水平的升高幅度显著缩小(p<0.05)。5.高表达XIAP对COMMD1和ATP7B的影响通过构建质粒高表达XIAP,与空载(Vector)组相比,XIAP高表达组铅处理后,所引起COMMD1蛋白水平增高、以及对ATP7B水平的下调作用均被显著抑制(p<0.05),但对ATP7A的水平无显著影响(p>0.05)。6.高表达XIAP对RBE4和Z310细胞铜水平的影响通过构建质粒高表达XIAP,与空载(Vector)组相比,XIAP高表达组铅处理后,胞内铜水平的升高幅度显著缩小(p<0.05)。7.XIAP调控COMMD1表达水平的功能结构域的研究分别以含有野生型和E3泛素连接酶位点突变型XIAP的质粒转染细胞后,与对照组相比,高表达野生型XIAP实验组COMMD1蛋白水平显著降低(p<0.05),而高表达E3泛素连接酶位点突变型XIAP实验组COMMD1蛋白水平没有显著变化(p>0.05)。结论:1.铅暴露可通过下调铜转运蛋白ATP7A和ATP7B的蛋白水平,而导致血-脑屏障和血-脑脊液屏障细胞内铜水平增高。2.铅暴露可以引起XIAP蛋白的表达水平降低,使其下游的COMMD1蛋白水平增高,进而特异性地下调ATP7B的蛋白水平,造成细胞铜外排障碍和胞内铜蓄积。3.XIAP-COMMD1-ATP7B的调控发生于蛋白水平,XIAP主要通过其具有E3泛素连接酶活性的RING结构域降解COMMD1。
