疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)NF-05漆酶的产生、特性及应用研究

半知菌论文 漆酶论文 染料降解论文 生物电催化论文
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漆酶,即p-对苯二酚:双氧氧化还原酶(laccase,p-diphenol:dioxygen oxidoreductase, EC1.10.3.2),是一种多酚类氧化还原蛋白,属于蓝多铜氧化酶家族(blue multicopper oxidoreductase, BMCOs)。本研究从伊春凉水国家级自然保护区土壤样品中分离到一株漆酶高产真菌,纯化了胞外漆酶蛋白,考察了生化、酶学、光谱学及电化学性质,并进行了转化芳香类化合物及降解合成染料的应用研究,获得主要结果如下:(1)漆酶高产真菌的分离鉴定从土壤样品中筛选到一株具有胞外漆酶活性的真菌NF-05,菌丝白色绒毛状呈同心轮状扩散生长,分生孢子由黄色至淡绿色,最终为墨绿色胶黏团块状;显微形态分生孢子宽梭状,分生孢子梗单生或丛生,顶端帚状分枝较多,边缘菌丝卷曲状分枝,壁有疣状突起,分生孢子座座状或浅杯状,为半知菌亚门(Deuteromycotina)漆斑菌属(Myrothecium. sp)真菌;rDNA-ITS序列片段长度544bp,在NCBI数据库进行BLAST比对分析(accession number HM347341),结合形态学研究结果,鉴定为疣孢漆斑菌(M.verrucaria)。(2)产酶条件的优化M.verrucaria NF-05在产酶基础培养基中发酵至第五天达到产酶高峰,初始酶活8.38U/ml,菌丝生长与胞外漆酶分泌部分耦合。菌株产酶最适碳源为4%葡萄糖,3%蛋白胨,培养基初始pH值7.0,装液量60ml/250ml,接种量4%,最适培养条件为30℃下140rpm振荡培养,没食子酸及Fe3+对菌株产酶有显著促进作用,NF-05产酶水平提高至12.82U/ml。响应面法(RSM)优化中PB设计结果表明葡萄糖、Cu2+和没食子酸对菌株产酶有显著影响,经最陡爬坡试验及中心组合试验(CCD),葡萄糖浓度为26.47g/l,Cu2+和没食子酸浓度分别为236.3μM和138.4μM时,模型拟合方程有极大值19.82U/ml,是初始酶活的2.37倍。(3)胞外漆酶的诱导Cu2+在0.1-4mM范围内对NF-05胞外漆酶有显著诱导作用,最优浓度为0.2mM,发酵液漆酶活性43.23U/ml;16种供试酚类对菌株产酶有明显诱导作用,阿魏酸效果最好,酶活达到234.15U/ml;14种显著诱导菌株产酶的胺类物质中,3,3-二甲基-4,4-二氨基联苯使酶活提高至258.11U/ml;6种非酚胺类漆酶底物也对NF-05漆酶产生有显著诱导效果,木质素磺酸钠浓度为1mM时,发酵液漆酶活性为267.92U/ml,是目前报道的真菌漆酶活性最高值;4种染料显著诱导产酶,偶氮类丽春红效果最好,酶活从对照处理的43.23U/ml提高至61.16U/ml。(4)蛋白的纯化与鉴定以M.verrucaria NF-05发酵液为粗酶液,采用硫酸铵盐析、DEAE-SepharoseFast Flow阴离子交换层析和SephadexG-75凝胶过滤层析纯化,经SDS-PAGE和native-PAGE检测,目的片段为单体蛋白,具有漆酶活性,分子量66kDa。N端10个氨基酸序列为APQISPQYPM,结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-/MS)对肽段序列的比对分析,鉴定所获M.verrucarid NF-05胞外目的蛋白为漆酶蛋白。(5)光谱学特性经电感耦合等离子体原子发射光谱(ICP-AES)测定,每个M.Verrucaria NF-05漆酶蛋白分子含铜离子3.08±0.3个,铁离子0.95±0.2个,二者比例为3:1。目的蛋白在300-650nm波长范围内全扫描,无特征吸收峰,顺磁共振(EPR)也未检测到磁性信号。我们推断M.Verrucaria NF-05漆酶蛋白中铜离子处于正一价态,全满状态的d10核外电子排布,不能产生d-d跃迁,易于电子传递,是造成光谱学“静默”的原因,也赋予NF-05漆酶异常高的酶活性。NF-05漆酶蛋白是一种活性中心金属组分及光谱学特性不同与已知报道的新白色漆酶。(6)酶学特性M.Verrucaria NF-05漆酶最适作用pH值4.0,最适作用温度40℃;Na+、 Mn2+、Cu2+和Zn2+对漆酶活性有显著促进;在5%供试有机溶剂中,漆酶活性保持在50%以上,常规蛋白抑制剂L-半胱氨酸、SDS、DTT和NaN3浓度为1mM时,酶活性基本丧失;卤族元素阴离子是供试漆酶特异性抑制剂;与常规漆酶底物ABTS亲和性较好,Km值为85.9μM。(7)对合成染料的脱色与降解偶氮类染料中,NF-05漆酶对橙黄Ⅰ和甲基橙脱色效果最好,无介体参与反应8天后脱色率即可达到90%以上;TE、VA和HBT对橙黄G6、ACE对苋菜红有明显促进脱色效果,脱色率达到90%以上。介体的参与可小幅提高NF-05漆酶对供试蒽醌类染料的脱色效率。芳甲烷类染料中碱性品红脱色效果最好。无介体参与并增大漆酶浓度后,反应10min时橙黄Ⅰ、铬黑T、碱性品红和苯酚红的特征吸收峰即完全被降解。(8)对芳香酚胺的转化NF-05漆酶对没食子酸等14种酚类底物、对氨基-N,N-二甲基苯胺等15种胺类底物及ABTS等6种非酚胺类底物的催化效率均高于两种对照商品酶。(9)电化学性质在充氮条件下,M.Verrucaria NF-05漆酶直接吸附于GP和GC裸电极上,与电极间均可进行直接电子转移,发生可逆的电化学反应;对过氧化氢的电催化还原效率均高于对照商品漆酶和胆红素氧化酶,过氧化氢氧化还原起始电势与裸电极相比均有明显正移。
摘要第4-6页
Abstract第6-8页
目录第9-15页
English catalog第15-21页
1 绪论第21-34页
    1.1 漆酶及其来源第21-23页
        1.1.1 漆酶的定义第21页
        1.1.2 漆酶的来源第21-23页
    1.2 漆酶的性质第23-24页
        1.2.1 漆酶的分子量第23页
        1.2.2 漆酶的等电点、最适反应温度与pH值第23页
        1.2.3 影响漆酶活性的因素第23-24页
    1.3 漆酶的结构与催化机理第24-27页
        1.3.1 漆酶的活性中心第24页
        1.3.2 漆酶的高级结构第24-25页
        1.3.3 漆酶的催化机理第25-27页
    1.4 微生物漆酶的合成与诱导第27页
        1.4.1 漆酶的合成位置第27页
        1.4.2 漆酶的诱导第27页
    1.5 漆酶的分子生物学研究第27-28页
        1.5.1 漆酶的氨基酸序列第27页
        1.5.2 漆酶基因的克隆第27-28页
        1.5.3 漆酶基因的表达第28页
    1.6 漆酶的应用第28-29页
        1.6.1 木质素降解第28-29页
        1.6.2 环境修复第29页
        1.6.3 染料脱色与解毒第29页
        1.6.4 其他应用第29页
    1.7 漆酶的电化学研究第29-32页
        1.7.1 漆酶的生物电催化第30页
        1.7.2 漆酶修饰电极第30-32页
        1.7.3 漆酶在电化学领域的应用第32页
    1.8 本研究的目的与意义第32-34页
2 产漆酶真菌的分离与鉴定第34-44页
    2.1 实验材料第34-37页
        2.1.1 采样地概况第34-35页
        2.1.2 主要仪器第35-36页
        2.1.3 主要试剂及试剂盒第36页
        2.1.4 培养基第36-37页
    2.2 实验方法第37-40页
        2.2.1 土壤样品采集第37页
        2.2.2 产漆酶真菌的富集与分离第37页
        2.2.3 产酶菌株的筛选第37页
        2.2.4 漆酶活力测定第37页
        2.2.5 显微形态观察第37-38页
        2.2.6 rDNA-ITS序列分析第38-40页
    2.3 结果与分析第40-42页
        2.3.1 土壤样品采集第40页
        2.3.2 漆酶高产真菌的分离与筛选第40-41页
        2.3.3 形态学鉴定第41-42页
        2.3.4 rDNA-ITS序列扩增与分析第42页
    2.4 讨论第42-43页
    2.5 本章小结第43-44页
3 M.verrucaria NF-05产漆酶条件研究第44-66页
    3.1 实验材料第44-45页
        3.1.1 主要仪器第44页
        3.1.2 主要试剂第44页
        3.1.3 主要软件第44页
        3.1.4 培养基第44-45页
    3.2 实验方法第45-47页
        3.2.1 种子液的制备第45页
        3.2.2 蛋白含量测定第45页
        3.2.3 菌体生长量测定第45页
        3.2.4 菌株生长及产酶进程的初步研究第45页
        3.2.5 碳、氮源对菌株产酶的影响第45-46页
        3.2.6 培养基初始pH值对菌株产酶的影响第46页
        3.2.7 装液量及接种量对菌株产酶的影响第46页
        3.2.8 培养温度对菌株产酶的影响第46页
        3.2.9 摇床转速对菌株产酶的影响第46页
        3.2.10 金属离子对菌株产酶的影响第46页
        3.2.11 常规漆酶底物对菌株产酶的影响第46页
        3.2.12 响应面法优化菌株产酶条件第46-47页
    3.3 结果与分析第47-63页
        3.3.1 蛋白测定标准曲线第47页
        3.3.2 M.verrucaria NF-05产酶及生长进程第47-48页
        3.3.3 碳、氮源对Mverrucaria NF-05产酶的影响第48-52页
        3.3.4 培养基初始pH值对Mverrucaria NF-05产酶的影响第52-53页
        3.3.5 装液量对Mverrucaria NF-05产酶的影响第53页
        3.3.6 接种量对Mverrucaria NF-05产酶的影响第53-54页
        3.3.7 培养温度对Mverrucaria NF-05产酶的影响第54-55页
        3.3.8 摇床转速对Mverrucaria NF-05产酶的影响第55-56页
        3.3.9 金属离子对Mverrucaria NF-05产酶的影响第56-57页
        3.3.10 常规漆酶底物对Mverrucaria NF-05产酶的影响第57-58页
        3.3.11 PB试验第58-60页
        3.3.12 最陡爬坡试验第60页
        3.3.13 中心组合试验第60-63页
        3.3.14 验证试验第63页
    3.4 讨论第63-65页
    3.5 本章小结第65-66页
4 M.verrucaria NF-05胞外漆酶的诱导第66-76页
    4.1 实验材料第66页
        4.1.1 主要仪器第66页
        4.1.2 诱导物第66页
        4.1.3 培养基第66页
    4.2 实验方法第66-69页
        4.2.1 铜离子对菌株产酶的诱导第66-67页
        4.2.2 酚胺类物质对菌株产酶的诱导第67页
        4.2.3 其他诱导物对菌株产酶的诱导第67页
        4.2.4 合成染料对菌株产酶的诱导第67-69页
    4.3 结果与分析第69-73页
        4.3.1 铜离子对菌株产酶的诱导第69-71页
        4.3.2 酚类物质对菌株产酶的诱导第71页
        4.3.3 胺类物质对菌株产酶的诱导第71-72页
        4.3.4 其他底物对菌株产酶的诱导第72页
        4.3.5 合成染料对菌株产酶的诱导第72-73页
    4.4 讨论第73-75页
    4.5 本章小结第75-76页
5 Mverrucaria NF-05 漆酶的纯化及其生化、光谱学和酶学性质第76-93页
    5.1 实验材料第76-77页
        5.1.1 主要仪器第76页
        5.1.2 主要试剂及缓冲液第76-77页
    5.2 实验方法第77-80页
        5.2.1 粗酶液的制备第77页
        5.2.2 硫酸铵盐析第77页
        5.2.3 蛋白纯化缓冲体系的确定第77页
        5.2.4 DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析第77-78页
        5.2.5 SephadexG-75凝胶柱过滤层析第78页
        5.2.6 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)第78页
        5.2.7 活性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)第78页
        5.2.8 N-端氨基酸序列测定第78页
        5.2.9 肽段序列的飞行时间质谱分析(MALDI-TOF-MS)第78-79页
        5.2.10 金属组分的原子发射光谱测定(ICP-AES)第79页
        5.2.11 光谱学特性第79页
        5.2.12 不成对电子的顺磁共振效应检测(EPR)第79页
        5.2.13 最适反应温度及热稳定性第79页
        5.2.14 最适反应pH值及pH稳定性第79页
        5.2.15 金属离子对漆酶活性的影响第79页
        5.2.16 有机溶剂对漆酶活性的影响第79页
        5.2.17 抑制剂对漆酶活性的影响第79-80页
        5.2.18 动力学参数测定第80页
    5.3 结果与分析第80-89页
        5.3.1 硫酸铵盐析饱和度第80页
        5.3.2 蛋白洗脱缓冲体系的确定第80-81页
        5.3.3 目的蛋白的分离纯化第81页
        5.3.4 表观分子量第81-82页
        5.3.5 N-端氨基酸序列测定第82页
        5.3.6 肽段序列分析第82-83页
        5.3.7 金属组分的测定第83页
        5.3.8 光谱学特性第83-84页
        5.3.9 不成对电子状态第84-85页
        5.3.10 最适反应温度及热稳定性第85页
        5.3.11 最适反应pH值及pH稳定性第85-86页
        5.3.12 金属离子对漆酶活性的影响第86-87页
        5.3.13 有机溶剂对漆酶活性的影响第87页
        5.3.14 抑制剂对漆酶活性的影响第87-88页
        5.3.15 漆酶在不同底物下的米氏常数第88-89页
    5.4 讨论第89-92页
    5.5 本章小结第92-93页
6 M.verrucaria NF-05漆酶对合成染料的脱色及酚胺类物质的转化第93-104页
    6.1 实验材料第93-94页
        6.1.1 主要仪器第93页
        6.1.2 主要试剂第93-94页
    6.2 实验方法第94-95页
        6.2.1 M.verrucaria NF-05漆酶在不同介体下对合成染料的脱色试验第94页
        6.2.2 M.verrucaria NF-05漆酶对合成染料的降解第94页
        6.2.3 M.verrucaria NF-05漆酶与商品酶催化氧化酚胺类物质的比较第94-95页
    6.3 结果与分析第95-100页
        6.3.1 不同介体介导的M.verrucaria NF-05漆酶对合成染料脱色研究第95-97页
        6.3.2 M.verrucaria NF-05漆酶对合成染料的降解第97-98页
        6.3.3 M.verrucaria NF-05漆酶与商品酶对酚胺类物质转化的比较研究第98-100页
    6.4 讨论第100-102页
    6.5 本章小结第102-104页
7 M.verrucaria NF-05漆酶电化学性质第104-110页
    7.1 实验材料第104-105页
        7.1.1 供试氧化还原蛋白第104页
        7.1.2 电化学工作站第104页
        7.1.3 电极第104-105页
    7.2 实验方法第105页
        7.2.1 氧化还原蛋白修饰工作电极的制备第105页
        7.2.2 M.verrucaria NF-05漆酶的直接电子转移(DET)第105页
        7.2.3 M.verrucaria NF-05漆酶对过氧化氢的电催化还原第105页
    7.3 结果与分析第105-108页
        7.3.1 M.verrucaria NF-05漆酶的直接电子转移第105-107页
        7.3.2. M.verrucaria NF-05漆酶对过氧化氢的电催化还原第107-108页
    7.4 讨论第108-109页
    7.5 本章小结第109-110页
结论第110-112页
参考文献第112-125页
攻读学位期间发表的学术论文第125-126页
致谢第126-127页
论文购买
论文编号ABS565904,这篇论文共127页
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