一株麻雀源坦布苏病毒全基因测序和传代研究

本研究从山东地区某发病鸭场周围的麻雀体内分离到一株坦布苏病毒，命名为SDS株，并用RT-PCR技术对分离株全基因组进行扩增并测序，将获得的SDS株坦布苏病毒全基因组序列与已在GenBank发表的24株坦布苏病毒和6株其他黄病毒属病毒全基因序列进行遗传进化分析。结果表明，该株坦布苏病毒的基因组全长为10990nt，包含94nt的5’端非编码区、618nt的3’端非编码区和一个开放阅读框（3425个氨基酸），编码11种病毒蛋白；与GenBank已发表的坦布苏病毒的核苷酸序列同源性为98.2％～99.5％，氨基酸序列同源性为98.1％～99.4％，其中与鸭源WFZ株（KC990545.1）的核苷酸序列同源性最高为99.5％，与鹅源坦布苏病毒（Duck egg-drop syndrome virus straingoose，JQ920424.1）和鸡源坦布苏病毒（CJD50，JF926699）的核苷酸序列同源性较低为98.9％。用NetNGlyc1.0Server在线软件对病毒蛋白潜在糖基化位点进行预测，结果表明在SDS株病毒多聚蛋白中共有13个潜在的糖基化位点，分别位于五个不同病毒蛋白中。本研究为坦布苏病毒流行病学调查提供了重要的理论依据。利用本试验分离株病毒进行传代研究，共连续传递了50代。第1-40代病毒用鸭胚传代培养，第41-50代病毒用鸭胚和鸡胚交替传代培养。成功传递50代后，对不同代次病毒的平均死亡时间和半数致死量进行测定，结果显示第10代病毒对鸭胚的MDT为84h左右，第50代病毒MDT为101h，第10代到50代病毒对鸭胚的半数致死量从10-2.9到10-2.6，变化不明显。随着传代次数增加病毒对鸭胚的致病力轻微致弱。对不同代次病毒提取RNA，扩增E基因全长片段后分析，结果显示，第10代到40代碱基替换和氨基酸突变不明显，第40代到50代出现7个碱基替换和5个氨基酸突变。由此在相同传代次数情况下在鸡胚和鸭胚上交替传代培养可能比只在鸭胚上传代培养引起更多变异。研究表明E蛋白存在三个活性结构域，结构域I、结构域II、结构域III，第50代的E蛋白在三个结构域中都有突变，其分布为I（2个）、II（1个）、III（2个）。用生物学信息软件以Jalneson一Wolf方法对不同代次E蛋白预测抗原指数，预测结果显示，10-40代的预测结果相同，50代预测结果在E蛋白439-444位置处抗原性指数较高与10-40代结果不同。第50代E蛋白在441位存在氨基酸变异，由甘氨酸突变为天冬氨酸。虽然抗原指数高由于种种原因并不代表一定能成为优势抗原表位，但该处变异可以为进一步的蛋白结构及功能研究和毒力位点研究提供理论基础。关于坦布苏病毒E蛋白氨基酸毒力相关位点目前还不清楚与明确，E基因变化是造成毒力减弱的原因，但不是唯一原因。研究表明，其他基因和非编码区的变异、缺失或插入也能引起黄病毒的毒力减弱。本试验数据可以为进一步的减毒机理研究和感染性cDNA克隆技术研究提供理论支持。