磷脂酶A1广泛存在于生物体内,并参与生物体内多种生理功能的调节,是一类可以水解磷脂的酶,其水解产物溶血磷脂可以作为食品添加剂和乳化剂等,广泛应用于食品加工、油脂脱胶、磷脂改性、医药等行业,有巨大的工业应用前景。目前工业上所用的磷脂酶A1是从国外进口。因此通过定向进化手段改造磷脂酶A1基因解决野生酶的酶活不高、产量低、酶活性质不稳定等问题是一项有意义的工作。本文利用易错PCR技术对来自粘质沙雷氏菌PL-06的磷脂酶A1基因plaB进行定向改造,通过引入不同浓度的Mg2+、Mn2+得到的易错PCR产物与表达型质粒pET-28a (+)重组,构建磷脂酶A1突变文库,利用目的产物磷脂酶A1可以产生水解透明圈,筛选出高酶活突变株M8。经过蛋白质表达SDS-PAGE、测序鉴定分析,带有磷脂酶A1辅助蛋白的磷脂酶A1基因表达产物为胞外分泌蛋白,plaB基因有11个碱基发生突变,导致6个氨基酸发生突变,其中磷脂酶Al蛋白有2个氨基酸突变,分别是Y97C、P98S,辅助蛋白有4个氨基酸突变,分别是P46L、Q58L、N136D、H233R。通过摇瓶发酵,优化突变株发酵产酶条件。结果表明突变株M8的最适诱导时间为2h,相对于野生酶的最适诱导时间4h缩短了诱导时间,最适诱导温度为37℃,最适IPTG诱导浓度为0.3mmol/L。突变株M8由最初酶活性19.6 U/mL至22.5 U/mL,相对于未突变前的菌株BP28的酶活16 U/mL提高了22.5%,比优化前提高了14.8%。经过对M8突变酶的酶学性质研究发现,M8突变酶最适pH值为7.0,pH稳定性相对于野生酶表现出耐碱性,但最适反应温度有所降低为40℃。通过生物信息学分析发现M8突变酶的空间结构未发现明显变化,磷脂酶A1的第98位氨基酸的突变可能对磷脂酶A1的酶活性产生影响。本文对磷脂酶A1基因(plaB)进行了体外定向改造,得到了一株酶活较高的突变株。对磷脂酶A1的结构与功能关系做了初步探讨。本研究不仅为磷脂酶A1的结构与功能的关系研究奠定了一定的基础,而且为开发高产且具有优良催化性能的磷脂酶A1提供理论依据。
