枯草芽孢杆菌纤溶酶高产菌株选育、发酵条件优化及其分离纯化

血栓栓塞性疾病是当前致死率高的病因之一，而溶栓疗法是治疗这类疾病的重要手段；纤溶酶可催化血栓的主要基质纤维蛋白水解从而化解血栓，因此纤溶酶作为血栓的特效治疗药剂而成为研究焦点。微生物是纤溶活性酶类的重要来源，日本学者从纳豆中发现纳豆激酶具有良好的纤溶活性；我国和韩国学者则从枯草芽孢杆菌发酵液中分离出相应的血栓溶解酶。由于野生型菌株产酶能力低，本文对一株枯草芽孢杆菌纤溶酶产生菌Bacillus subtilis XZ3④进行N+离子注入诱变，获得了高产菌株Bacillus subtilis XZI125，并对该菌的发酵条件进行优化，同时研究了枯草芽孢杆菌纤溶酶的分离纯化，旨在为枯草芽孢杆菌纤溶酶的开发应用提供直接理论依据。主要结论如下：1．以能量20 KeV，入射剂量为30×2.6×1013 ion／cm2～200×2.6×1013 ion／cm2的N+注入枯草芽孢杆菌纤溶酶产生菌B. subtilis XZ3④进行诱变育种，其存活率曲线为典型的“马鞍型”，即随着注入剂量的增加存活率呈现先降后升再降的趋势；筛选284株诱变菌，得到一株稳定的高产枯草芽孢杆菌纤溶酶的菌株B. subtilis XZI125，枯草芽孢杆菌纤溶酶酶活比原始菌株提高了160％，达到1230.45 u·ml-1。2．采用Plackett-Burman设计法，从26个因素中筛选出了影响B. subtilis XZI125液体发酵产枯草芽孢杆菌纤溶酶的9个主要影响因子：麸皮、甘油、硫酸铵、豆粕、植酸、二甲亚砜、发酵温度、发酵时间和装液量。3．在Plackett-Burman实验基础上，通过中心旋转组合设计（Central Composite Rotatable Design，CCRD）法建立了枯草芽孢杆菌纤溶酶酶活对发酵培养基6个关键组份的二次多项数学模型，并利用统计学方法以及后续试验对该模型进行了显著性检验和有效性验证。借助模型方程的响应面图及其等高线图，对关键影响因素间的交互作用进行了深入的研究与探讨，分析得出了各关键营养要素的合适浓度水平范围。对枯草芽孢杆菌纤溶酶模型方程解逆矩阵求得：即在麸皮1.70％、甘油1.30％、硫酸铵0.07％、豆粕3.94％、植酸282.64ppm、二甲亚砜5.84ppm时，获得的枯草芽孢杆菌纤溶酶酶活最大预测值为2382.00 u·ml-1，此预测可信度不仅被统计分析所验证，也被实践所证实。4．在Plackett-Burman和CCRD实验基础上，采用Box-Behnken统计学实验设计方法对影响B. aubtilis XZI125液体发酵产枯草芽孢杆菌纤溶酶的3个关键外界影响因素发酵温度、发酵时间和装液量的最佳水平范围及其交互作用进行了研究与探讨。通过对模型方程3D图及其等高线图的研究，发现在发酵温度31.58℃、发酵时间48.54h、装液量53.81ml的工艺条件下，获得的枯草芽孢杆菌纤溶酶酶活最大预测值可达2665.16 u·ml-1。5．在摇瓶液体发酵实验结果的基础上，于100L发酵罐中初步探索了溶解氧和pH对B. subtilis XZI125分批液体发酵产枯草芽孢杆菌纤溶酶的影响。结果表明：在通气量控制在1.0vvm的前提下，当恒定搅拌转速250rpm，恒定发酵液pH7.0时，下罐发酵粗酶液达到了2876.94 u·ml-1，比摇瓶液体发酵提高了211.78 u·ml-1。6．N+离子诱变筛选所得的酶活高产菌B. subtilis XZI125的发酵液经微滤（0.1μm无机陶瓷膜），超滤（中空纤维膜UPIS-503、UEOS-503）和HZD-2弱酸性阳离子交换层析分离纯化出一种电泳纯的枯草芽孢杆菌纤溶酶，其比活力为4291.03 u·mg-1，纯化倍数为18.34，回收率为24.58％，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得相对分子量为27.7KDa。