靶向VEGFR-3的多肽TMTP2在恶性肿瘤靶向治疗中的应用研究

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研究背景与目的近年来,VEGF-C/VEGFR-3信号通路在多项研究中被证实介导实体瘤周及瘤内新生淋巴管生成过程中起重要的作用,该信号通路是肿瘤淋巴管生成的关键环节,同时对肿瘤细胞的移动、浸润以及转移也起到了非常重要的作用。大量的临床病理研究表明肿瘤细胞中VEGF-C或VEGF-D的表达与多种肿瘤的转移直接相关。最近有研究表明,在小鼠黑色素瘤模型中利用重组腺相关病毒的基因治疗方法表达可溶性VEGFR-3可阻断淋巴结的转移。这些研究结果提示,阻断VEGFR-3信号通路能有效抑制淋巴结转移,也有可能降低远处器官转移的发生率。所以,基于该通路在肿瘤转移以及淋巴管生成过程的重要性,阻断该信号途径的相关研究有望成为抗肿瘤淋巴转移治疗新的有效手段。在前期的研究中应用新型细菌鞭毛展示随机肽库技术对重组活性蛋白VEGFR-3的胞外区进行筛选,经体外验证测序获得一段5肽序列,命名为"TMTP2";本研究拟选择肿瘤淋巴管及淋巴管生成为研究靶点,通过建立体内外淋巴管生成及肿瘤相关模型来探讨验证TMTP2与淋巴管内皮细胞的靶向识别效应,以及对淋巴管生成及肿瘤转移的靶向阻遏效应;旨在为多肽载体的应用带来新的理论依据和实践经验,如能进而利用该多肽载体携带化疗药物进行靶向肿瘤淋巴管生成与转移的治疗,则有望提供一个早期诊断转移和控制肿瘤转移和复发的多肽药物,为肿瘤的分子治疗带来新的契机和希望。方法通过体外三维培养的方法建立淋巴管体外成管模型,再通过相关的软件分析体外形成的管样结构进行分析;在C57BL/6小鼠角膜微袋中移植TC-1细胞相应肿瘤,通过HE染色及免疫荧光的方法检测肿瘤及肿瘤淋巴管的新生;在BALB/c小鼠乳腺皮下脂肪垫处注射小鼠来源的乳腺癌4T1细胞,建立自发性肺及其他器官的转移模型,2-3周分别取肺组织于体视显微镜下观察,并且通过HE染色进一步验证;在BALB/c裸鼠的乳腺原位脂肪垫皮下注射人类乳腺癌细胞系MDA-MB-231建立乳腺癌异种移植模型,通过染色观察肿瘤内部淋巴管的生成及转移情况。通过尾静脉注射或者显微注射的方法将带有荧光标记多肽注射到小鼠或者斑马鱼的体内,不同时间点取下组织,利用免疫荧光的方法检测多肽的分布及靶向情况。通过建立乳腺癌原位移植模型、角膜微袋肿瘤生长模型及模式生物-斑马鱼,检测TMTP2在新生淋巴管生成过程中的靶向识别作用,通过尾静脉注射或者显微注射的方法将带有荧光标记多肽注射到小鼠或者斑马鱼的体内,不同时间点取下组织,利用免疫荧光的方法检测多肽的分别及靶向情况。利用上述模型体内验证多肽TMTP2-DKK对上述模型的肿瘤及淋巴管新生的靶向阻遏作用。体外先对4T1细胞进行不同浓度多肽TMTP2-DKK的处理,再通过Transwell试验验证多肽TMTP2-DKK处理后的细胞对迁移侵袭的影响;在构建的乳腺癌转移模型中验证多肽TMTP2-DKK在体内对转移的抑制效应;显微镜观察计算多肽处理后的小鼠肺部的转移灶,HE染色进一步验证其转移灶的组织结构。结果与空白对照组对比,HLEC体外三维培养6h后,VEGF-C融合蛋白组中形成更多的管腔样结构,随着培养时间的增加,最后形成复杂的闭合三维淋巴管网;角膜微袋肿瘤移植的小鼠从第5天出现肉眼可见的血管新生的变化,由7天直至14天血管生长更加明显;在BALB/C小鼠4T1乳腺癌转移模型中,在肿瘤细胞移植4周后所有被种植的小鼠均发生较大的原发肿瘤,同时在肺部可见多个转移结节;小鼠乳腺癌原位异种移植模型也可见皮下瘤不同程度的生长;TMTP2对LEC细胞有很好的亲和效应,在实验组的细胞胞浆内可见很强的绿色荧光,也有部分细胞核内也有较强的荧光,而在对照肽组只有蓝色的核染色之外,没有其他的荧光;在小鼠的乳腺癌及全角膜的切片中均可见较强的多肽表达荧光,而在错序对照肽无相关的荧光表达;同样在斑马鱼的胸导管内也有绿色荧光的分布;在体外成管试验中,未处理组与添加了VEGFC组都有明显的管状结构形成,而TMTP2-DKK及TMTP2-DKK+VEGFC处理组成管均明显减少,错序肽以及TMTP2则对成管没有抑制作用;在乳腺癌的荷瘤小鼠中,TMTP2-DKK处理组的肿瘤体积明显小,瘤体重量明显较对照组轻,且内部淋巴管的数目也较对照组少;在TMTP2-DKK处理组的角膜成瘤整体要比对照组小,且组化结果淋巴管的数目明显少于对照组;在斑马鱼的试验中,与对照组相比,TMTP2-DKK处理后发生明显的心包水肿及胸导管分离,高倍视野下观察到斑马鱼胸导管缺失;在体外Transwell试验中,与对照组相比,TMTP2-DKK处理组的细胞穿过率明显减少;TMTP2-DKK处理组的小鼠肿瘤体积及重量明显小于对照组,肺转移率也较对照组降低;HE染色对可见肺局部有大量的转移灶;结论本研究成功建立了体外三维淋巴管成管模型、体内的角膜微袋肿瘤模型、乳腺癌转移模型及裸鼠原位异种移植瘤模型,为淋巴管新生及肿瘤淋巴管生产及相关信号通路的研究提供了理想的动物模型;多肽TMTP2对表达VEGFR-3的LEC及在体内肿瘤及相应的淋巴管均有很好的靶向识别效应;偶联DKK后,可以抑制淋巴管的发生,且可抑制肿瘤的转移;多肽TMTP2如能与抗肿瘤药物如阿霉素等偶联,将大大提高肿瘤早期治疗的靶向性和高效性,可能成为临床上靶向阻遏肿瘤淋巴管的生成与抑制肿瘤转移的一种全新的诊断和治疗工具;
縮略语表第6-8页
中文摘要第8-11页
Abstract第11-14页
研究背景第15-24页
    参考文献第20-24页
第一部分 淋巴管发生及肿瘤转移相关模型的建立第24-49页
    中文摘要第24-26页
    Abstract第26-28页
    前言第28-30页
    材料与方法第30-35页
    结果第35-41页
    讨论第41-45页
    参考文献第45-49页
第二部分 TMTP2在体外对淋巴管内皮细胞LEC的靶向识别效应研究第49-58页
    中文摘要第49-50页
    Abstract第50-51页
    前言第51-52页
    材料与方法第52-53页
    结果第53-55页
    讨论第55-56页
    参考文献第56-58页
第三部分 TMTP2在体内对肿瘤及新生淋巴管靶向识别效应研究第58-74页
    中文摘要第58-59页
    Abstract第59-60页
    前言第60页
    材料与方法第60-66页
    结果第66-69页
    讨论第69-72页
    参考文献第72-74页
第四部分 TMTP2-DDK的肿瘤靶向治疗及淋巴管新生的靶向阻遏作用第74-92页
    中文摘要第74-75页
    Abstract第75-77页
    前言第77-78页
    材料与方法第78-82页
    结果第82-86页
    讨论第86-89页
    参考文献第89-92页
第五部分 TMTP2-DKK靶向抑制肿瘤转移的研究第92-109页
    中文摘要第92-93页
    Abstract第93-94页
    前言第94-95页
    材料与方法第95-100页
    结果第100-103页
    讨论第103-105页
    参考文献第105-109页
综述 淋巴管生成与肿瘤转移机制及相关信号分子通路的研究进展第109-130页
    参考文献第122-130页
已发表文章第130-132页
在读期间发表的文章目录第132-133页
致谢第133-135页
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