目的1.通过建立大鼠大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型和体外缺氧神经干细胞(neural stem cells, NSCs)损伤模型,免疫荧光双标记检测NSCs增殖分化,观察叶酸对缺血缺氧损伤NSCs增殖分化的影响,明确叶酸能否通过促进NSCs增殖分化对脑梗死大鼠产生神经保护作用。2.通过检测Notch信号通路和ERK信号通路相关基因mRNA和蛋白表达,在抑制ERK通路条件下进一步观察NSCs增殖分化,探讨叶酸对缺血缺氧损伤NSCs增殖分化调控机制。3.通过凋亡率及凋亡基因芯片和线粒体凋亡途径相关蛋白表达检测,观察叶酸对缺氧损伤NSCs凋亡的影响,探讨叶酸对NSCs凋亡调控的可能机制,为研究叶酸对缺血缺氧性脑损伤的防治提供科学依据。方法1.SD大鼠随机分为假手术组(Sham-OP)、中动脉栓塞组(MCAO)、中动脉栓塞+叶酸低剂量组(MCAO+LFA)和中动脉栓塞+叶酸高剂量组(MCAO+HFA)。栓线法制备大鼠MCAO模型, Sham-OP组和MCAO组以生理盐水10ml/kg·bw·d灌胃, MCAO+LFA组和MCAO+HFA组以叶酸溶液4mg/kg·bw·d和12mg/kg·bw·d灌胃,干预28d后制备MCAO模型,进行神经功能评分和脑组织含水量检测,氯化四氮唑(TTC)染色检测脑梗死体积百分比,测定血清叶酸和同型半胱氨酸(Hcy)含量变化,TUNEL法检测神经细胞凋亡率,HE染色观察脑组织病理改变,Y迷宫检测各组学习记忆能力,免疫荧光双标记检测脑组织内源性NSCs增殖分化,Western blot测定脑组织β-Tubulin-Ⅲ蛋白表达。原位杂交检测脑组织在梗死后不同时间点Notch1、Hes1/5、Mash1、Ngn1/2基因mRNA表达,Western blot检测梗死侧脑组织Notch1、Hesl/5以及pERK1/2蛋白表达。U0126阻断ERK通路后,再次检测内源性NSCs增殖和pERKl/2蛋白表达。2.体外培养新生SD大鼠NSCs,细胞分为正常对照组(Control),缺氧损伤组(Hypoxia),缺氧叶酸低剂量组(Hypoxia+FA-L),缺氧叶酸高剂量组(Hypoxia+FA-H)和缺氧叶酸缺乏组(Hypoxia+FA-D)。各组叶酸终浓度分别为4μg/ml、44μg/ml和0.65μg/ml,在1%02中缺氧损伤8h。MTT法检测细胞活力,增殖第6d以免疫组化双标记法检测NSCs增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡率,分化第6d以Western blot检测GFAP和β-Tubulin-Ⅲ蛋白。实时定量PCR检测细胞增殖和分化期Notch1、Hesl/5、Mash1、Ngnl/2以及ERK1/2基因mRNA表达,Western blot检测Notch1、Hes1/5和pERK1/2蛋白表达。U0126阻断ERK通路后检测NSCs增殖和pERK1/2蛋白表达。凋亡基因芯片检测Hypoxia和Hypoxia+FA-H组NSCs凋亡相关基因表达差异,Western blot检测各组NSCs的细胞色素C (Cyt C)、Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3/9蛋白表达,检测各组培养基Hcy浓度。结果1.叶酸对脑梗死大鼠内源性NSCs和体外缺氧NSCs增殖分化的影响：叶酸补充可升高大鼠血清叶酸浓度,降低其血浆Hcy水平,叶酸干预组大鼠神经功能损伤程度和脑梗死体积小于MCAO组,学习记忆能力高于MCAO组,MCAO+HFA组大鼠脑组织含水量和神经细胞凋亡率低于MCAO(P<0.05)。各组大鼠内源性NSCs增殖能力在脑梗死后7d达到高峰,MCAO+HFA组大鼠脑组织BrdU+Nestin+细胞数量高于其他各组(P<0.05)。各组大鼠脑组织BrdU+GFAP+细胞和BrdU+NeuN+细胞数量在脑梗死后14d达到高峰,MCAO+HFA组高于其他各组(P<0.05),同时叶酸干预组脑组织β-Tubulin-Ⅲ蛋白表达高于MCAO组(P<0.05)。体外实验中,缺氧损伤后,两叶酸添加组细胞活力高于Hypoxia组,Hypoxia+FA-D组细胞活力低于Hypoxia组(P<0.05)。增殖第6d,两叶酸添加组BrdU+estin+细胞率高于Hypoxia组,且Hypoxia+FA-H组高于Hypoxia+FA-L组;而Hypoxia+FA-D组BrdU+Nestin+细胞率则低于Hypoxia组(P<0.05)。分化第6d,Hypoxia+FA-H组GFAP蛋白表达高于Hypoxia组,(3-tubulin-III蛋白表达低于Hypoxia组,Hypoxia+FA-D组该两种蛋白表达均低于其他各组(P<0.05)。2.叶酸对脑梗死大鼠脑组织和体外缺氧NSCs Notch和ERK信号通路相关基因表达的影响：大鼠脑梗死后7d, MCAO+HFA组Notch1、Hesl/5 mRNA和蛋白表达高于其他各组,两叶酸干预组Mashl mRNA表达低于MCAO组(P<0.05),MCAO+HFA组Ngnl/2 mRNA表达强度低于其他各组(P<0.05)。体外实验中,无论增殖期还是分化期,Notch1、Hesl/5mRNA和蛋白在Hypoxia+FA-H组表达量最高,在Hypoxia+FA-D组表达量最低(P<0.05)。Mash1、Ngn1/2 mRNA在Hypoxia+FA-H组表达量最低(P<0.05)。大鼠脑梗死后7d,MCAO+LFA组和MCAO+HFA组pERK1/2蛋白表达高于MCAO组(P<0.05)。U0126阻断ERK通路后,可以降低叶酸干预组pERK1/2蛋白的高表达和脑组织BrdU+Nestin+细胞数(P<0.05)。体外实验中,Hypoxia+FA-L组和Hypoxia+FA-H组在增殖期pERK1/2蛋白表达高于Hypoxia组和Hypoxia+FA-D组(P<0.05)。U0126阻断ERK通路可降低叶酸干预组的细胞活力和BrdU+Nestin+细胞率,同时抑制pERK1/2蛋白表达(P<0.05)。3.叶酸对体外缺氧NSCs凋亡的影响和线粒体凋亡途径的作用：增殖第6d,Hypoxia组细胞凋亡率高于Control组、Hypoxia+FA-L组和Hypoxia+FA-H组,而低于Hypoxia+FA-D组(P<0.05)。Hypoxia+FA-H组与Hypoxia组相比,表达上调的基因有bcl2和Hprtl,下调的基因有p53、apaf-1、bax以及caspase-3/9o Western blot检测结果显示Cyt C、Bax、Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白表达量在两叶酸添加组均低于Hypoxia组,Hypoxia+FA-D组高于Hypoxia组；Bcl-2蛋白在两叶酸添加组均高于Hypoxia组,Hypoxia+FA-D组低于Hypoxia组(P<0.05)。结论叶酸对脑梗死大鼠的神经保护作用与促进其内源性NSCs增殖有关,体外实验证明叶酸对缺氧损伤NSCs的增殖和向星形胶质细胞细胞分化有促进作用,对体外缺氧NSCs向神经元分化有一定抑制作用,叶酸缺乏则抑制缺血缺氧环境中NSCs的增殖分化。Notch信号通路和ERK信号通路在叶酸对NSCs增殖分化影响中起重要作用,而叶酸对体外缺氧NSCs凋亡的抑制作用与线粒体途径有关。
