高产谷胱甘肽酿酒酵母发酵过程的控制与优化

还原型谷胱甘肽（GSH）是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸组成的非蛋白巯基化合物，广泛存在于动物、植物和微生物细胞中。GSH参与细胞中许多生理活动，主要作为抗氧化剂、解毒剂和增强机体免疫功能。近年来，日本科学家发现GSH还具有抑制艾滋病病毒的功效。在食品工业中添加GSH不仅可以强化食品风味，而且有保健作用。目前我国主要从日本、欧美进口GSH，所以采用高产谷胱甘肽酿酒酵母，利用廉价的原料，发酵生产GSH进行大规模生产，能填补我国在这一领域的空白，具有巨大的社会效益和经济效益。本文以高产GSH酿酒酵母为生产菌株，首次采用糖蜜和葡萄糖两种碳源先后流加的方式，达到同时提高酵母细胞量和胞内GSH含量的目的；前体氨基酸添加后，首次采用流加葡萄糖的方式来替代价格昂贵的ATP，以满足胞内GSH合成对能量的需求，并取得较好效果，并逐步探讨从250mL摇瓶，30L发酵罐到60M3的放大过程。本文主要从以下三个方面进行研究：1.在摇瓶水平上，通过正交试验对发酵条件进行优化，得到最佳发酵条件：初始pH5.5，发酵温度30℃，摇床转速为200rmp/min，装液量为25mL/250mL，接种量为10%。在最佳发酵条件下，通过单因素试验确定了高产谷胱甘肽酿酒酵母最佳的碳源以及氮源组成，利用Plackett-Burman试验设计、Box-Behnken试验设计结合响应面分析法对发酵培养基进行优化，得到的最佳培养基组成为：葡萄糖25.95g/L，酵母粉11.47g/L、硫酸铵10.16g/L，硫酸镁0.2g/L，磷酸氢二钾2g/L，GSH的产量为170.459mg/L，比前人得到的GSH产量124.77mg/L提高了40.65%。2.在30L发酵罐水平上，通过物料衡算和发酵程序的设计，确定了先流加糖蜜后流加葡萄糖的方式。此方法比单一流加葡萄糖的GSH产量提高了16.6%；比单一流加糖蜜的GSH产量提高了16.4%。3.通过前体氨基酸的添加，胞内GSH含量大幅提高。前体氨基酸添加后，每6h检测一次胞内GSH的含量，发现前体氨基酸加入24h后，胞内GSH含量基本稳定，以此确定最佳放罐时间。通过单因素试验对前体氨基酸的添加量进行研究，确定L-谷氨酸30mmol/L、 L-半胱氨酸30mmol/L和甘氨酸18mmol/L为最佳氨基酸添加量。通过对发酵后期pH的调控，确定前体氨基酸添加后，发酵液pH维持在4.5最利于胞内谷胱甘肽的合成。然后，通过对发酵后期添加ATP与调控葡萄糖的流加速率的对比，发现流加廉价的葡萄糖来代替价格昂贵的ATP是可行的。最后，在60M~3发酵罐上进行发酵试验，经过48h发酵，GSH含量达到43.071mg/g，菌体干重为33.48g/L，GSH产量达到1442.017mg/L。说明运用此发酵工艺从30L发酵罐放大到60M~3可行的。