胰腺癌是一种起病隐匿,早期诊断困难,恶性程度高,手术切除率低,放化疗不敏感的消化系统肿瘤,占恶性肿瘤的1%-2%。在美国,胰腺癌排名恶性肿瘤死因的第4位。2011年,美国胰腺癌新发病例数为44030例,死亡37660例,5年生存率仅有6%。胰腺癌的发病率存在明显的地域差异,经济发达和工业化程度高的地区发病率也高。随着近年来经济的发展,污染的加重,生活习惯的改变,中国胰腺癌的发病率也逐年上升。据上海市流行病学统计数据,2008年上海市胰腺癌发病率已上升至男性7.26/10万,女性4.95/10万。由于缺乏特异性的症状和体征,胰腺癌发现时往往已经到了中晚期,失去、了最佳治疗的时机。虽然采取了积极的治疗方法,如手术、化疗、放疗等,但是胰腺癌的预后并没有得到明显改善。胰腺癌的发生发展过程中伴随着癌基因及其受体的活化以及抑癌基因的失活和丢失。随着医学科学的不断发展,对胰腺癌生物学特性和相关机制研究的不断深入,基于干预胰腺癌相关基因异常变化的分子靶向治疗给胰腺癌的治疗带来了曙光。如果将分子靶向治疗和传统治疗方式联合很有可能会改善胰腺癌的预后,提高胰腺癌患者的生活质量和生存时间。异粘蛋白(metadherin, MTDH)又称AEG-1、LYRIC或3D3,位于人类8号染色体(8q22),包含11个内含子和12个外显子,是近年来新发现的一个癌基因,其所在区域被认为和多种恶性肿瘤的发生发展高度相关。MTDH已被证实在人体绝大部分组织器官均有不同程度的表达,并且在多种恶性肿瘤中异常高表达,其表达高低被认为和多种恶性肿瘤的分化、TNM分期及预后相关。目前的研究表明MTDH可以通过调控PI3K/Akt、NF-κB、Wnt/β-catenin、MAPK等多条信号通路而影响肿瘤的发生、增殖、抗凋亡、侵袭、转移、血管生成、耐药、自噬等多个环节。MTDH很可能作为一个广谱性的标志物,在恶性肿瘤的诊断、治疗及预测预后中发挥巨大作用。目前国内外尚未有MTDH与胰腺癌发病的相关报道。在本课题中,我们首先通过高通量组织芯片免疫组织化学技术分析了MTDH在胰腺癌和配对癌旁组织的表达模式,以及MTDH在癌组织中表达高低与患者临床病理特征的关系和潜在预测预后的价值,证实MTDH评分和吸烟、分化、淋巴转移及TNM分期相关,并且是胰腺癌独立的预后因素。其次,我们检测了MTDH在不同胰腺癌细胞系中的表达差异,选取高表达MTDH的胰腺癌细胞株PANC-1和SW1990为研究对象,采用RNA干扰技术,构建MTDH的RNAi慢病毒载体,并获得了稳定干扰MTDH表达的胰腺癌细胞株。最后,我们通过体内外实验研究抑制MTDH表达后,胰腺癌细胞的增殖凋亡及侵袭转移能力的变化,证实了干扰胰腺癌中MTDH的表达,可以抑制胰腺癌细胞的增殖和侵袭转移,促进胰腺癌细胞的凋亡。进一步研究发现,MTDH可以通过Akt/mTor通路的影响胰腺癌的生物学行为。MTDH作为胰腺癌的独立预后因素以及潜在治疗靶点,值得我们进一步研究。第一部分MTDH在胰腺癌临床组织中的表达及其预后意义目的：研究胰腺癌中MTDH在癌组织和癌旁组织中的表达差异,分析MTDH与胰腺癌患者临床病理特征及预后的关系。方法：通过组织芯片免疫组化染色检测89对胰腺癌及配对癌旁组织的MTDH蛋白水平的表达情况。使用秩和检验分析MTDH染色评分和吸烟、CA19-9高低、TNM分期、生存时间等临床病理资料的相关性,累计生存时间和累计生存率采用Kaplan-Meier法,生存检验采用Log-rank法,采取Cox比例风险模型进行单因素和多因素分析。结果：组织芯片免疫组化结果提示,MTDH蛋白在胰腺癌组织的表达水平要高于配对癌旁组织(高表达率：癌58/89,65.2%；癌旁23/89,25.8%),在胰腺癌组织中MTDH蛋白表达主要在胰腺癌细胞浆,尤其在核周表达较明显,而在癌旁正常导管中,MTDH染色较浅,且一般为均匀分布于细胞浆中。胰腺癌组织MTDH蛋白高表达(染色指数>6)与生存时间短(P=0.000),吸烟(P=0.029),肿瘤细胞分化差(P=0.014),淋巴转移(P=0.012), TNM分期晚(P=0.036)相关。Kaplan-Meier法分析MTDH评分高低(P=0.000)、肿瘤分化高低(P=0.002)、TNM分期早晚(P=0.036),CA19-9高低(P=0.048)的患者生存时间存在统计学差异。进一步行Cox回归多因素分析提示MTDH是胰腺癌患者术后死亡风险的独立危险因素(HR=2.638,95%CI=1.537-4.528, P=0.000)。结论：在人胰腺癌中MTDH蛋白普遍较癌旁组织异常高表达,主要表达在胞浆尤其是核周。MTDH的高表达与的临床病理因素(分化差、淋巴转移、TNM分期晚)显著相关,并且与胰腺癌公认的发病高危因素(吸烟)相关。MTDH染色评分与患者的预后密切相关,是胰腺癌患者术后死亡风险的独立危险因素。第二部分MTDH基因特异性shRNA真核表达载体的构建及稳定转染重组载体胰腺癌细胞的建立目的：构建MTDH基因特异性shRNA真核表达载体,建立稳定干扰MTDH表达的胰腺癌细胞,用于MTDH对胰腺癌生物学特性影响的体内体外实验和机制的研究。方法：Western blot检测人胰腺癌细胞系中MTDH的表达,选择高表达MTDH的细胞系为后续研究对象。设计合成MTDH基因特异性的shRNA序列,以慢病毒载体pLK0.1TRC cloning vector为基础构建MTDH基因特异性shRNA重组真核表达载体。包装生成相应慢病毒并转染胰腺癌细胞系,嘌呤霉素筛选稳定表达重组载体的胰腺癌细胞系。采用PCR技术和Western Blot技术验证和筛选MTDH基因抑制效应最为显著的稳定转染细胞株。结果：Western blot结果显示在6株胰腺癌细胞系中PANC-1和SW1990中MTDH蛋白含量最高。设计合成的MTDH基因特异性shRNA单链成功退火形成双链shRNA。经酶切和测序鉴定,双链shRNA插入真核表达载体位置正确。用重组质粒包装慢病毒并成功转染PANC-1和SW1990细胞,采用嘌呤霉素成功筛选获得稳定表达重组质粒的胰腺癌细胞株。经PCR和Western blot验证和筛选,选择MTDH基因抑制效果最为显著的PANC-shMTDH2和SW1990-shMTDH2为后续实验用细胞系。结论：成功构建了MTDH基因特异性shRNA真核表达载体,建立了稳定干扰MTDH表达的胰腺癌细胞。PCR和Western blot结果显示PANC-shMTDH2和SW1990-shMTDH2为MTDH下调最明显的细胞株。为后续研究MTDH对胰腺癌生物学特性影响的体内体外实验和机制的研究打下了基础。第三部分干扰MTDH表达对胰腺癌恶性潜能的影响及分子机制研究目的：研究干扰MTDH对于胰腺癌细胞系PANC-1和SW1990体外增殖、周期、凋亡、迁移和侵袭能力的影响；研究干扰MTDH对于裸鼠SW1990皮下瘤生长的影响；初步探索胰腺癌中干扰MTDH后增殖转移相关指标的变化及对Akt/mTor通路的影响。方法：通过CCK-8法检测细胞增殖能力,PI染色法分析细胞周期,Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡,平板克隆形成实验比较细胞增殖和群体依赖性变化,细胞划痕实验评估细胞迁移能力,Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力。通过裸鼠皮下瘤模型研究干扰MTDH对SW1990皮下成瘤的影响。利用Western blot检测Ki67, Cyclin D1, E-cadherin, MMP-9及Akt/mTor通路关键分子的变化,探索胰腺癌中干扰MTDH对Akt/mTor通路的影响。结果：CCK-8细胞增殖实验提示,下调MTDH表达水平后,不同时间点的PANC-1和SW1990细胞系的增殖能力明显减弱。细胞周期分析提示：干扰MTDH后,人胰腺癌细胞PANC-1和SW1990均出现G1增多,G2和S期减少,发生G1期阻滞。检测细胞凋亡发现,减少MTDH表达后,PANC-1和SW1990发生晚期凋亡和发生早期凋亡均较对照组明显增多。平板克隆实验证实MTDH表达的下调明显抑制了PANC-1和SW1990的增殖以及增加了其群体依赖性。细胞划痕实验证实MTDH表达减少后PANC-1和SW1990迁移能力明显减弱。Transwell侵袭实验提示PANC-1和SW1990干扰MTDH后,穿过Transwell小室的细胞数较对照组明显减少。SW1990体外皮下瘤模型提示与对照组相比,RNAi组肿瘤的重量和体积均较小,且组间具有统计学差异。Western blot检测干扰MTDH后Ki67, CyclinD1,MMP-9表达下调,E-cadherin表达上调,Akt/mTor通路中的关键分子显著变化,提示胰腺癌中MTDH可以通过调控Akt/mTor通路影响胰腺癌的生物学行为。结论：以MTDH为靶点的RNAi可以有效抑制人胰腺癌细胞PANC-1和SW1990的增殖、侵袭和迁移,造成G1期阻滞,并增加细胞凋亡,有效改善胰腺癌细胞的恶性表型。进一步的机制探索表明MTDH RNAi可以下调Ki67, Cyclin D1, MMP-9的表达,上调E-cadherin的表达,并可通过调控Akt/mTOR通路抑制胰腺癌的恶性潜能。创新点1.国内外首次采用高通量组织芯片技术研究MTDH在胰腺癌和癌旁组织的表达及预后价值。2.国内外首次较系统的研究了MTDH对胰腺癌增殖、周期、凋亡、侵袭和转移能力的影响。潜在应用价值1. MTDH可以作为独立的胰腺癌术后患者预后的分子预测标志。2. MTDH RNAi作为胰腺癌治疗药物具有广泛的研究应用前景。
