螺蛳多糖的提取、分离、结构和活性研究

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螺蛳(Bellamy a purificata)属于软体动物门(Mollusca)、腹足纲(Gastropoda)、前鳃亚纲(Prosobranchia)、田螺科(Vivipariidae),是一种体外裹着一层锥形或纺锤形硬壳的软体动物,它广泛分布于我国长江流域及广东等地。现有的糖生物学研究表明,贝类多糖具有抗肿瘤、调节免疫、抗病毒等多种功效,且毒副作用较小,受到广大专家学者的关注。本文从螺蛳腹足肌中提取分离多糖,并对纯化所得的单一多糖组分的结构和活性进行了研究,为螺蛳多糖的利用与开发提供参考。通过单因素试验和响应面分析法对螺蛳多糖的提取条件进行了优化,得到最佳提取工艺如下:料液比1:28(w/v),提取温度75℃,浸提时间5.2h。经苯酚-硫酸法测定最佳提取条件下的多糖得率为2.52%,该条件下所得多糖提取液冷冻干燥后得多糖粗品命名为CBPS。在分离纯化研究中,比较了三氯乙酸法、Sevag法、木瓜蛋白酶-Sevag法和胰蛋白酶-Sevag法等脱蛋白工艺的优劣,综合考虑蛋白质的去除率、多糖的损失率、试剂的消耗等因素,选择了先以胰蛋白酶酶解,然后以Sevag试剂反复脱蛋白4次的工艺流程。在此基础上进一步研究了透析、DEAE-sephacel离子交换柱层析和Sepharose 6B凝胶柱层析等纯化手段在分离纯化CBPS中的应用,最终确定将CBPS溶液用截留分子量为14kDa的透析袋对水透析,而后用DEAE-sephacel离子交换柱(1.6×40cm)和Sepharose 6B凝胶柱(1.6×120cm)进一步纯化,分级得到两个多糖组分,分别命名为BPS-1和BPS-2。经高效液相凝胶色谱和醋酸纤维素电泳分析表明BPS-1和BPS-2为单一组分。通过化学法对BPS-1和BPS-2的组成进行分析,结果表明BPS-1和BPS-2的总糖含量(以无水葡萄糖计)分别为99.14%和97.06%,其中葡萄糖醛酸含量分别为18.58%和17.87%,氨基葡萄糖含量分别为12.91%和18.98%,并且还含有少量的硫酸基,分别为2.13%和2.47%。完全酸水解-气相色谱分析表明BPS-1是以葡萄糖为主,微量的海藻糖、阿拉伯糖、木糖组成,其摩尔百分比为96.14%:1.71%:0.97%:1.18%;BPS-2是以葡萄糖为主,微量的海藻糖、阿·拉伯糖、木糖、甘露糖和半乳糖组成,其摩尔百分比为94.71%:1.98%:1.43%:0.58%:0.44%:0.86%。凝胶渗透色谱法测得BPS-1和BPS-2的分子量分别为7.2×106Da和8.3×106Da。红外光谱分析表明,组成BPS-1和BPS-2的单糖为吡喃糖,且以α-糖苷键连接。部分酸水解、高碘酸氧化、Smith降解、甲基化-气质分析、以及1H NMR 13C NMR分析表明,BPS-1的基本骨架由α-(1→4)糖苷键连接的葡萄糖构成,侧链为α-(1→3)糖苷键连接的葡萄糖和非还原末端残基,它们均通过α-(1→6)糖苷键与主链葡萄糖相连;BPS-2的基本骨架由α-(1→4)糖苷键连接的葡萄糖构成,两条支链则由α-(1→3)糖苷键连接的葡萄糖和非还原末端残基构成,它们分别通过α-(1→3)和α-(1→6)糖苷键与主链葡萄糖相连。BPS-1的基本结构为:BPS-2的基本结构为:通过鼠耳肿胀法抗炎实验表明BPS-1和BPS-2均具有抗炎活性,且在一定浓度范围内,与浓度呈正相关。在浓度范围0.05~1.0mg/ml内,BPS-1和BPS-2对鼠耳肿胀程度的抑制率分别在14.02~57.56%和11.07~56.46%之间,两者抗炎效果基本相同;纸片扩散法抑菌实验分析表明BPS-1和BPS-2仅对革兰氏阴性菌具有抑菌活性,且BPS-1的抑菌能力略高于BPS-2;体外抗氧化DPPH·清除实验表明BPS-1和BPS-2不具有显著的DPPH·清除能力;MTT法体外抗肿瘤活性测定表明,BPS-1和BPS-2体外抑制肝癌细胞HepG2增殖的活性不显著。
摘要第3-7页
ABSTRACT第7-10页
第1章 绪论第15-28页
    1.1 螺蛳简介第15-16页
    1.2 螺蛳及贝类多糖的研究现状第16-25页
        1.2.1 贝类多糖的分离纯化第16-19页
        1.2.2 贝类多糖的结构研究第19-23页
        1.2.3 贝类多糖的活性研究第23-25页
    1.3 本课题的选题背景、研究意义及研究内容第25-28页
        1.3.1 选题背景及研究意义第25-26页
        1.3.2 研究内容及思路第26-28页
第2章 螺蛳多糖的提取条件的优化第28-41页
    2.1 材料、试剂及仪器第28-29页
        2.1.1 试验原料第28页
        2.1.2 试验试剂第28页
        2.1.3 试验仪器第28-29页
    2.2 实验方法第29-31页
        2.2.1 螺蛳肌肉组织的制备第29页
        2.2.2 螺蛳肉基本成分分析第29页
        2.2.3 螺蛳粗多糖提取工艺流程第29页
        2.2.4 粗多糖中总糖含量的测定第29-30页
        2.2.5 螺蛳多糖提取的单因素试验第30-31页
        2.2.6 响应面试验确定最佳提取条件第31页
    2.3 结果与讨论第31-41页
        2.3.1 螺蛳肉中营养成分含量第31页
        2.3.2 苯酚-硫酸法测定粗多糖中总糖含量第31-32页
        2.3.3 螺蛳多糖提取工艺的优化第32-34页
        2.3.4 响应面优化提取工艺第34-40页
        2.3.5 本章小结第40-41页
第3章 螺蛳多糖的纯化和分离第41-56页
    3.1 试剂与仪器第41-42页
        3.1.1 试剂与材料第41页
        3.1.2 仪器第41-42页
    3.2 实验方法第42-45页
        3.2.1 纯化工艺流程第42页
        3.2.2 脱蛋白工艺的研究第42-44页
        3.2.3 脱蛋白螺蛳多糖中各组分的分离第44-45页
        3.2.4 多糖纯度鉴定第45页
    3.3 结果与讨论第45-54页
        3.3.1 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量第45-46页
        3.3.2 不同除蛋白方法的脱蛋白效果第46-49页
        3.3.3 离子交换柱层析纯化第49-51页
        3.3.4 凝胶柱层析纯化第51-52页
        3.3.5 螺蛳多糖的纯度分析第52-54页
    3.4 本章小结第54-56页
第4章 螺蛳多糖的结构研究第56-89页
    4.1 试剂与仪器第57-58页
        4.1.1 试剂与材料第57页
        4.1.2 实验仪器第57-58页
    4.2 实验方法第58-65页
        4.2.1 总糖含量测定第58页
        4.2.2 己糖醛酸含量分析第58-59页
        4.2.3 氨基己糖及硫酸基含量的测定第59-61页
        4.2.4 分子量测定第61页
        4.2.5 官能团分析第61页
        4.2.6 单糖组成分析第61-62页
        4.2.7 部分酸水解第62页
        4.2.8 高碘酸氧化与Smith降解第62-63页
        4.2.9 甲基化分析第63-64页
        4.2.10 的核磁共振分析第64-65页
    4.3 结果与讨论第65-87页
        4.3.1 总糖含量第65页
        4.3.2 糖醛酸含量第65-67页
        4.3.3 氨基己糖含量第67-68页
        4.3.4 硫酸基含量第68-69页
        4.3.5 分子量第69-70页
        4.3.6 红外光谱特征第70-72页
        4.3.7 单糖组成分析第72-76页
        4.3.8 高碘酸氧化与Smith降解第76-79页
        4.3.9 甲基化第79-82页
        4.3.10 NMR谱第82-87页
    4.4 本章小结第87-89页
第5章 螺蛳多糖的活性研究第89-99页
    5.1 试剂与仪器第89-90页
        5.1.1 试剂第89页
        5.1.2 试验材料第89-90页
        5.1.3 试验仪器第90页
    5.2 实验方法第90-92页
        5.2.1 抗炎实验-鼠耳肿胀法第90页
        5.2.2 体外抑菌实验第90-91页
        5.2.3 体外抗氧化活性第91-92页
        5.2.4 体外抗肿瘤活性测定(MTT法)第92页
    5.3 结果与讨论第92-97页
        5.3.1 鼠耳肿胀法抗炎效果第92-93页
        5.3.2 抑菌活性第93-94页
        5.3.3 DPPH清除效果第94-95页
        5.3.4 体外抗肿瘤活性第95-97页
    5.4 本章小结第97-99页
第6章 结论与创新第99-101页
    6.1 结论第99-100页
    6.2 论文创新性第100-101页
参考文献第101-110页
附录一 中英文名词术语对照表第110-111页
附录二 研究生期间所发表的论文第111-112页
致谢第112-113页
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