血浆长链非编码RNA应用于前列腺癌早期诊断的研究

目的：通过血浆中lncRNA的存在性和稳定性实验，证明lncRNA或其片段可以作为前列腺癌血浆分子诊断标记物；通过细胞实验、动物实验和临床验证，研究血浆中lncRNA或其片段的来源；通过对临床标本中来源于lncRNAMALAT-1的短链RNA（命名为MD-miniRNA）的表达差异性研究，探索MD-miniRNA在前列腺癌血浆诊断中的潜在应用价值。方法：本研究按照研究目标分成三大部分。（1）运用8个前列腺癌病人的血浆样本，进行血浆中lncRNA的存在方式研究；分别测定在PCA3和MALAT-1全长上每隔1000bp的特异性片段的表达量。运用25个不同病人血浆或血清样本，进行反复冻融、室温放置、-80℃冻存、酸碱处理和RNAse处理等对血浆中lncRNA片段表达影响的研究，系统阐述血浆中lncRNA或其片段的生物学特性。（2）体外实验和体内实验分别阐明循环血液中MD-miniRNA的来源。选择6种不同的前列腺细胞系，包括1种正常前列腺细胞（PWR-1E）和5种不同的前列腺癌细胞（22RV1，LNCap-AD，LNCap-AI，C4-2和PC3），分别取培养1天、2天和3天的细胞上清，论证前列腺肿瘤细胞分泌MD-miniRNA；使用22RV1移植瘤动物模型，取成瘤后的小鼠血液，论证肿瘤的存在是血液中高表达MD-miniRNA的原因；运用10对前列腺癌根治术前和术后血浆标本，进一步论证前列腺癌病人血液中高表达MD-miniRNA来源于前列腺肿瘤。（3）运用192例病人血浆样本，包括87例前列腺穿刺阳性病人、82例前列腺穿刺阴性病人和23例正常对照，论证MD-miniRNA的诊断价值。qRT-PCR检测血所有血浆和血清样本中lncRNA及其片段的表达情况。应用标准曲线法计算MD-miniRNA的绝对量。应用AUC-ROC方法统计检测指标的诊断效能。实验所用样本均为最新诊断且取样前未经任何治疗的病人样本。结果：运用全基因组扫描找到了前列腺癌组织中包括MALAT-1和PCA3在内的前列腺癌高表达的lncRNA。血浆中lncRNA是以表达丰度不同的片段存在，并且在血浆中非常稳定。前列腺肿瘤细胞能分泌MD-miniRNA并释放到培养液中，从而在培养液中可以检测其表达。在肿瘤种植的小鼠血浆中能检测出MD-miniRNA的表达，其表达量显著高于对照组。前列腺癌根治术后血浆MD-miniRNA表达显著下降且与血清PSA下降一致。另外，在对192个临床病人血浆进行MD-miniRNA检测发现，前列腺癌病人血浆中MD-miniRNA的表达量显著高于非恶性肿瘤病人（p<0.001）。运用867.8拷贝数/μl血浆作为截断点进行研究，结果显示，MD-miniRNA对区分前列腺穿刺阳性和阴性病人(PSA>4ng/ml)的敏感性和特异性分别为：58.6%、84.8%；区分在PSA=4-10ng/ml范围内前列腺穿刺阳性和阴性病人的敏感性和特异性分别为：43.5%、81.6%；区分前列腺癌和非前列腺癌病人的敏感性和特异性分别为：58.6%、84.8%。结论：血浆中lncRNA是以表达丰度不同的片段稳定存在。MD-miniRNA可以作为一种新型的前列腺癌血浆中分子诊断标记物，并能显著提高前列腺穿刺的阳性率。本研究的实验结果尚需大样本对照研究进一步证实。