目的：探讨颗粒酶B、姜黄素和两种治疗方法联合对人肝癌Huh-7裸鼠皮下种植瘤的抑制作用,以及颗粒酶B基因表达对Caspase-3, Bcl-2等凋亡基因的影响；姜黄素对肿瘤细胞凋亡的作用。探讨颗粒酶B联合姜黄素可能的杀伤肿瘤的机制,为寻找原发性肝细胞癌新的治疗靶点提供实验依据。方法：构建设计携带Granzyme B基因的载体质粒,扩增质粒后转染进入裸鼠皮下种植瘤。选取25只4-6周龄BALB/c裸小鼠,18-22g/只。取第4-6代对数期肝癌细胞胰酶消化后,抽取细胞浓度为1×10~7/ml悬液150ul,接种裸鼠的颈背部皮下。待肿瘤增大至5-7mm,将符合条件的25只裸鼠随机分为5组,每组为5只裸鼠。A组为Granzyme B基因转染治疗组,B组为姜黄素治疗组,C组为GranzymeB联合姜黄素治疗组,D组为空白质粒组,E组为空白对照组。A组：予GranzymeB转染试剂瘤内注射,每日一次。B组：予姜黄素100ul瘤内注射,每日一次。C组：予GranzymeB转染试剂,姜黄素100ul间隔注射,每日一次。D组：予空白质粒转染试剂瘤内注射,每日一次。E组：仅注射Opti-MEM无血清培养基100ul每日一次。期间每五天测量裸鼠体重,肿瘤体积,并制作肿瘤生长曲线。15天后处死裸鼠,测量肿瘤直径,肿瘤重量；行肿瘤组织标本常规病理学检查；并荧光实时定量PCR检测颗粒酶B、Caspase-3﹑Bcl-2基因表达情况。结果：扩增后质粒纯度达到满足后续实验要求。裸鼠成瘤率100％,5天后在皮下摸到小结节。12天后肿瘤体积达到5-7mm。注射治疗的3组(A、B、C组)肿瘤生长速度明显减慢,瘤体增大不明显,C组瘤体增长较A、B组缓慢。空白质粒(D)组和空白对照(E)组,瘤体体积每5天均有增长,对比注射治疗的三组,体积增大最为明显。瘤体病理切片镜下观察：D组及E组肿瘤细胞密集排列,片状坏死区面积较小,细胞大小不一,形态各异,核大深染,可见核分裂象,核固缩较少。A、B、C组肿瘤细胞均有坏死,可见到细胞核完全溶解,细胞结构消失,均质、红染的细胞坏死表现,还可见到凋亡细胞,细胞质浓缩,细胞核深染固缩。其中以C组肿瘤细胞最为明显,可见到细胞呈大片坏死,空泡性变。通过荧光实时定量PCR分析：Granzyme B基因的A、C组,其Granzyme B, Caspase-3基因的表达量相对E组上升,Bcl-2基因的表达量相对E组下降。姜黄素治疗的B、C组,其Caspase-3基因的表达量相对E组上升,Bcl-2基因的表达量相对E组下降,而D组无论是Caspase-3基因还是Bcl-2基因的表达量相对E组均无明显差异。
