环氧丙烷皂化废水活性污泥中微生物的耐盐度驯化及群落分析

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环氧丙烷废水具有高温、高盐度、高pH、高悬浮物等特点是一种难处理的工业废水,随着每年环氧丙烷的工业用量不断的增加,环氧丙烷废水的有效治理成为国内外研究的重点。目前国内处理环氧丙烷废水主要是生物法,通过对废水的冷却、沉降、曝气等处理使其达到污水的国家排放标准。其中最主要的环节是通过活性污泥里的微生物对污水中有机污染物进行降解,但是一般情况下高浓度的含氯废水对微生物具有毒害作用,主要表现在废水的高渗透压破坏了微生物的细胞膜和膜内酶,使其菌株的代谢能力受到影响。因此环氧丙烷废水在处理前先要经过稀释,降低氯离子浓度后,才能进行废水处理,从而造成了稀释用水的大量浪费。为了节约资源、减少耗能,需要通过污泥驯化提高活性污泥微生物的提高活性污泥微生物耐盐度。实验中首先对环氧丙烷废水活性污泥进行了驯化,采用梯度驯化法,氯离子浓度从11000mg/L开始,逐步提高氯离子的浓度,最终驯化结果使氯离子浓度达到20000mg/L。经过调节适应期,外排水的COD、pH等指标均达到国家标准。不过提高氯离子浓度后,外排水氨氮含量有所增加,据推测这可能与活性污泥微生物的群落结构变化有关。运用三种分子生物学方法:末端限制性片段长度多态性分析(T-RFLP),构建16SrDNA文库,变性梯度凝胶电泳(DGGE)对活性污泥微生物群落结构进行了分析比较。实验首先提取了S1、S2、S3,三个样品活性污泥的宏基因组,分别是耐盐度为18000mg/L(鼓风曝气池取样),18000mg/L(接触氧化池取样),22000mg/L(鼓风曝气池取样)皂化废水活性污泥。在T-RFLP中,运用BIO-DAP软件分析,S1样品的多样性指数Margalef index、Shannon index、Pielou index和Simpson index都是最高的,相反S3的多样性指最低。通过Phylogenetic Assignment Tool在线分析,三种样本的优势菌主要为拟杆菌门(Bacteroidetes),厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria),其中绿弯菌门(Chloroflexi)是S3样本中所特有的优势菌种。以S3为模板构建了16SrDNA文库。通过对目的基因的转化、筛选、鉴定,发现绿弯菌门(79%)在S3中占绝对优势,其次是变形菌门(19%),酸杆菌门(1%)和未培养细菌(1%)。通过DGGE条带明暗度分析和序列比对,得出S3中优势菌为绿弯菌门(61.09%),变形菌门(15.24%),未培养的菌种(9.68%)。三种方法结果显示,环氧丙烷皂化废水活性污泥微生物群落中优势菌主要是绿弯菌门和变形菌门,T-RFLP中还发现了厚壁菌门,构建16SrDNA文库和DGGE的方法共同检测出具有未分类的菌群,因此活性污泥微生物群落结构是复杂多样的。但是三种方法均未发现降解氨氮的硝化菌,这既与实验方法本身的限制有关,也说明硝化菌在体系中占的比例较小。外排水氨氮浓度升高可能与硝化菌占的比例较小有关。实验发现了假单胞菌属、芽孢杆菌属在活性污泥微生物群落中占有一定的比例,据报道这两种菌属中具有高效降解氨氮的菌株,好氧菌Bacillus sp.绿曲挠丝状菌属(Chloroflexus aggregans)具有降解有机氯化物的作用。这就为下一步实验研究指明了方向。
摘要第8-10页
Abstract第10-11页
第一章 绪论第12-22页
    1.1 环氧丙烷废水的概述第12-16页
        1.1.1 环氧丙烷第12-13页
        1.1.2 环氧丙烷生产工艺流程第13页
        1.1.3 环氧丙烷废水特征第13页
        1.1.4 环氧丙烷废水的国内外处理现状第13-16页
    1.2 分子生物学技术在微生物群落研究中的应用第16-20页
        1.2.1 宏基因组学第16-17页
        1.2.2 末端限制性片段长度多态性分析第17-19页
        1.2.3 16S rDNA 基因文库第19页
        1.2.4 变性梯度凝胶电泳第19-20页
    1.3 本章小结第20-22页
第二章 环氧丙烷废水活性污泥微生物群落耐盐度驯化第22-28页
    2.1 实验材料和仪器第22页
        2.1.1 实验用样第22页
        2.1.2 实验装置第22页
    2.2 实验方法第22-24页
        2.2.1 环氧丙烷废水处理工艺、装置及流程第22-23页
        2.2.2 环氧丙烷废水污泥生物耐盐度驯化第23-24页
    2.3 结果与讨论第24-26页
    2.4 本章小结第26-28页
第三章 运用 T-RFLP 方法分析环氧丙烷废水活性污泥中微生物群落结构第28-38页
    3.1 实验材料和仪器第28-29页
        3.1.1 实验用样第28页
        3.1.2 主要试剂第28-29页
        3.1.3 主要仪器第29页
        3.1.4 主要试剂的配制第29页
        3.1.5 引物序列第29页
    3.2 实验方法第29-33页
        3.2.1 活性污泥总 DNA 的提取第29-30页
        3.2.2 琼脂糖凝胶电泳检测第30-31页
        3.2.3 T-RFLP第31-33页
    3.3 结果与讨论第33-36页
        3.3.1 活性污泥样品中总 DNA 的提取第33页
        3.3.2 T-RFLP 分析第33-36页
    3.4 小结第36-38页
第四章 16S rDNA 文库法分析环氧丙烷废水活性污泥微生物群落结构第38-46页
    4.1 实验材料和仪器第38-40页
        4.1.1 实验样品第38页
        4.1.2 实验试剂第38-39页
        4.1.3 实验仪器第39页
        4.1.4 主要试剂配制第39-40页
    4.2 实验方法第40-43页
        4.2.1 16S rDNA PCR 扩增第40-41页
        4.2.2 PCR 产物的纯化第41页
        4.2.3 目的基因的连接第41页
        4.2.4 感受态细胞 Escherichia coli DH5α的制备(CaCl_2法)第41-42页
        4.2.5 重组质粒的转化及筛选第42页
        4.2.6 阳性克隆的鉴定第42-43页
        4.2.7 阳性克隆子测序第43页
    4.3 结果讨论第43-45页
        4.3.1 16S rDNA 的 PCR 扩增第43-44页
        4.3.2 蓝白筛阳性克隆子的鉴定第44页
        4.3.3 阳性克隆子测序第44-45页
    4.4 本章小结第45-46页
第五章 DGGE 分析环氧丙烷废水活性污泥中微生物群落结构第46-56页
    5.1 实验材料和仪器第46-48页
        5.1.1 实验用样第46页
        5.1.2 主要试剂第46-47页
        5.1.3 主要仪器第47页
        5.1.4 主要试剂配制第47页
        5.1.5 引物序列第47-48页
    5.2 实验方法第48-52页
        5.2.1 活性污泥 DNA 的提取第48页
        5.2.2 PCR 扩增第48页
        5.2.3 DGGE 分析第48-49页
        5.2.4 DGGE 克隆测序第49-52页
    5.3 结果讨论第52-55页
        5.3.1 PCR 扩增第52页
        5.3.2 DGGE 图谱分析第52-53页
        5.3.3 DGGE 克隆分析第53-55页
    5.4 小结第55-56页
第六章 结论与展望第56-60页
    6.1 结论第56-58页
    6.2 展望第58-60页
参考文献第60-64页
致谢第64-66页
附录第66页
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